Cy3/5/7 NHS ester和帶NH2多肽和抗體連接實驗方法及步驟

Cy3 NHS ester, Cyanine5 NHS ester和Cyanine7 NHS ester可以標記含有amine的多肽，抗體，蛋白，DNA和寡核苷酸及其他小分子。在反應條件下NHS可以和NH2發(fā)生反應，從而連接到一起。

（一）：Cyanine5 NHS ester和多克隆抗體的連接實驗方法和步驟

【準備材料】：

Cy3 NHS ester purchased from xi an ruixibio

anti-GST多克隆抗體purchased from Abcam

【實驗步驟】：

1.      在1 L 0.15 M NaCl 溶液中透析anti-GST抗體(濃度為 0.5 mL at3 mg/mL)，常溫透析4小時。

2.      在4°C用新鮮的1 L 0.15 M NaCl 溶液再透析過夜。

3.      第二天用1 L 0.1 M NaHCO3 (pH 8.3)透析4小時。

4.      用0.22 μm注射器過濾頭過濾抗體溶液。

5.      用0.1 M NaHCO3 稀釋少量的抗體，在280nm處測其紫外吸收值計算標記抗體的總量 (IgG antibody摩爾吸光系數(shù)170 000 M-1 cm-1 at 280 nm).

6.      用DMSO配置Cy3 NHS (MW 616.19)溶液濃度為10 mg/mL;計算所需體積以得到想要的Cy3NHS 和抗體的比值(例如20:1)，然后慢慢將其加入到抗體溶液中，同時在暗處常溫緩慢攪拌45分鐘。

7.      用1 L 0.15 M NaCl 溶液常溫避光透析4小時除去未標記上的Cy5。

8.      在4°C用新鮮的1 L 0.15 M NaCl 溶液再避光透析過夜。

9.      用1 L of 0.01 M PBS/ 0.01% 疊氮化鈉溶液常溫避光透析4小時, 在4°C常溫避光再次透析過夜。

10.  用0.22 μm注射器過濾頭過濾抗體溶液。

11.  用0.01 M PBS/0.01 % 疊氮化鈉整數(shù)倍稀釋標記抗體溶液，測量280nm(蛋白)和552nm(Cy)處的紫外可見吸光度。

12.  產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或在0.01 M PBS/ 0.01% 疊氮化鈉溶液中，-20℃避光儲存。

F/P計算：

Cy3在552nm摩爾吸光系數(shù)為150 000M-1 cm-1;此蛋白在280nm的摩爾吸光系數(shù)為170 000 M-1 cm-1;

不同蛋白的摩爾吸光系數(shù)不一樣;.Cy3染料本身在280 nm 的吸收是552nm處的8%。按以下公式計算F/P

值。

[Cy3] = A552/150000

[antibody] = {A280 - (0.08×A552)}/170000

F/P final= [Cy3]/[antibody]= {1.13×A552}/{A280 - (0.08×A552)}

（二）：Cyanine5 NHS ester和標記 (D-ser2)-leucineenkephalin的連接實驗方法和步驟

【準備材料】：

Cy5 NHS ester purchased from xi an ruixibio

(D-ser2)-leucineenkephalin purchased fromsigma

【實驗步驟】：

1.      Cy5 NHS 1.0 mg 溶解于400 μL DMSO后，加入到1mL 的玻璃瓶中盛有(D-ser2)-leucine-enkephalinacetate(YSGFLT, 0.75 mg) 的400 μL DMSO溶液。(Dye 和peptide 投料比是 1:1)

2.      然后加入15 μL三乙胺，常溫避光攪拌反應混合物過夜。

3.      用HPLC 純化蛋白，使用蛋白C18柱子(25 cm×10 mm)，每次上樣注入2×400 μL，30分鐘梯度洗脫從0.1% TFA水溶液到MeCN∶H2O(0.1% TFA)=70∶30，流速4mL /min。(對不同的蛋白選擇不同的合適HPLC梯度流動相)

4.      收集適當?shù)纳珟Х澹瑯擞浂嚯牡谋Ａ魰r間比未標記的多肽長。

5.      產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或在水溶液中，-20℃避光儲存;必要時可用質(zhì)譜表征。

6.      CyDye標記的蛋白穩(wěn)定性取決于蛋白本身。例如標記的IgG在4 ℃可避光保存2月;更長期的保存需加入等體積的甘油-20 ℃避光保存.

F/P計算：

Cy5 在650 nm 的摩爾吸光系數(shù)為250 000 M-1 cm-1 ，所用蛋白在280 nm處的摩爾吸光系數(shù)為 170

000 M-1 cm-1;Cy5在280nm處的吸收是650nm處的5%。按以下公式計算F/P值。

[Cy5 dye] = (A650)/250 000

[peptide] =[A280 -(0.05×A650)]/170 000

F/P final= [dye]/[peptide]= {0.68×A650}/{A280 - (0.05×A650)}

西安瑞禧生物科技有限公司產(chǎn)品種類：

Cyanine3 alkyne

Cyanine3 azide

Cyanine3 carboxylic acid  1144107-76-5

Cyanine3 hydrazide

Cyanine3 maleimide

Cyanine3 NHS ester   1032678-38-8

Cyanine3.5 azide

Cyanine3.5 carboxylic acid  1144107-79-8

Cyanine3.5 NHS ester

Cyanine5 alkyne

Cyanine5 amine

Cyanine5 azide

Cyanine5 Boc-hydrazide

Cyanine5 carboxylic acid

Cyanine5 hydrazide

Cyanine5 maleimide

Cyanine5 NHS ester  1032678-42-4

Cyanine5.5 alkyne

Cyanine5.5 azide

Cyanine5.5 carboxylic acid  1144107-80-1

Cyanine5.5 maleimide

Cyanine5.5 NHS ester

Cyanine7 amine   1650635-41-8

Cyanine7 azide

Cyanine7 carboxylic acid

Cyanine7 maleimide

Cyanine7 NHS ester

Cyanine7.5 amine

Cyanine7.5 azide

Cyanine7.5 carboxylic acid   1686147-68-1

Cyanine7.5 maleimide

Cyanine7.5 NHS ester

Sulfo-Cyanine 5 NHS ester

Sulfo-Cyanine3 azide

Sulfo-Cyanine3 carboxylic acid

Sulfo-Cyanine3 maleimide

Sulfo-Cyanine3 NHS ester

Sulfo-Cyanine5 alkyne

Sulfo-Cyanine5 azide

Sulfo-Cyanine5 carboxylic acid   1121756-16-8

Sulfo-Cyanine5 maleimide

Sulfo-Cyanine7 azide

Sulfo-Cyanine7 carboxylic acid

Sulfo-Cyanine7 NHS ester

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