內(nèi)容提要

目前大多數(shù)近紅外探針存在信號(hào)轉(zhuǎn)換低、光穩(wěn)定性差、探針特異性差、功能受限等問(wèn)題。本文設(shè)計(jì)合成了一種具有超高吸收性的近紅外croconium克酮酸染料(CDA-3)，該染料可特異地與β-淀粉樣蛋白(Aβ)纖維的疏水通道緊密結(jié)合，在800 nm處有強(qiáng)吸收峰，低功率激光照射下可產(chǎn)生明顯的局部溫度波動(dòng)，從而產(chǎn)生很強(qiáng)的光聲信號(hào)。這種染料經(jīng)過(guò)放射性¹⁸F標(biāo)記后，可以對(duì)大腦皮質(zhì)中的Aβ斑塊進(jìn)行超靈敏光聲斷層掃描(PAT)/正電子發(fā)射斷層掃描(PET)/熒光三模式成像。PAT具有較高的空間分辨率和光學(xué)特異性，適合于成像皮質(zhì)血管的病理部位；PET顯示全身解剖，定量的生物分布信息，因此，本文報(bào)道的croconium克酮酸染料通過(guò)PAT和PET能夠診斷和定位斑塊。

前言

近紅外(NIR)染料以其高量子產(chǎn)量、良好的生物相容性和快速清除的特性在材料化學(xué)、光學(xué)成像和相關(guān)生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中得到了廣泛的關(guān)注。近紅外熒光(NIRF)成像由于其操作簡(jiǎn)單、成本低、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種病理生理程序的檢測(cè)和臨床前應(yīng)用。大多數(shù)近紅外染料具有極低的疾病靶向性和結(jié)合能力，目前還沒(méi)有合理或理想的方法來(lái)開(kāi)發(fā)一種具有互補(bǔ)成像能力的近紅外染料用于正電子發(fā)射斷層掃描(PET)/光聲斷層掃描(PAT)或PAT/ PET/NIR熒光在一個(gè)平臺(tái)上。大腦淀粉樣血管病(Cerebral amyloid angiopathy, CAA)常見(jiàn)于阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)患者，其特征是β淀粉樣蛋白(amyloid beta, Aβ)沉積于腦軟腦膜動(dòng)脈、皮層動(dòng)脈和靜脈壁?？紤]到Aβ沉積可以同時(shí)或單獨(dú)地發(fā)生在血管壁和腦實(shí)質(zhì)中，因此制定一個(gè)精確的策略來(lái)確定體內(nèi)CAA是至關(guān)重要的。作者設(shè)計(jì)了一個(gè)croconium克酮酸染料對(duì)β淀粉樣蛋白足夠的滲透率，靶向結(jié)合血小板在血管；具有很強(qiáng)的吸收近紅外光譜范圍內(nèi)并產(chǎn)生一個(gè)更強(qiáng)的光聲信號(hào)；該染料能夠以較強(qiáng)的結(jié)合能與斑塊的疏水性氨基酸強(qiáng)結(jié)合，顯著地提高檢測(cè)靈敏度，首次在轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠模型中靶向Aβ斑塊成像的評(píng)估。此外，利用¹⁸F標(biāo)記的croconium克酮酸染料實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)的全身PET成像。本文的研究可能為早期檢測(cè)腦斑塊提供一種新的工具，并揭示神經(jīng)血管功能障礙(如血管狹窄和破裂以及相關(guān)的癡呆)背后的確切機(jī)制。

結(jié)果與討論

受芳香環(huán)-共軛橋-芳香環(huán)平面骨架結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，作者報(bào)道了一系列具有croconium生物相容性染料(圖1a和b)。具有電子給體-p-受體-p-供體結(jié)構(gòu)的CDA具有良好的近紅外吸收性能(CDA-1 604 nm, CDA-2 779 nm, CDA-3 798 nm)。CDA的croconium環(huán)是一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)型中離子化合物，具有一個(gè)電子受體核和一個(gè)電子供體翅膀，導(dǎo)致了較強(qiáng)的近紅外吸收(圖1c-e)。這兩種噻吩結(jié)構(gòu)也是給體電子給體，通過(guò)與疏水通道的結(jié)合促進(jìn)了Aβ的高親和力。如圖1f所示，優(yōu)化后的CDA化合物構(gòu)型為梯形，兩個(gè)親水端基伸長(zhǎng)。對(duì)接結(jié)果表明CDA-3位于Val18上方，與Lys16平行并傾斜，CDA-3的羧酸離子與賴(lài)氨酸的羧基之間形成氫鍵(圖1g)。目前大多數(shù)探針與6-碘- 2-(4-二甲氨基)苯咪唑[1,2-a]吡啶(IMPY)共用同一個(gè)位點(diǎn)，并嵌入疏水的Val18_Phe20通道。結(jié)果表明，CDA化合物嚴(yán)格地進(jìn)入了結(jié)合袋。Lys16_Val18_Phe20親疏水雙通道縱向運(yùn)行至纖維軸。隨著單體數(shù)量的增加，隨著纖維伸長(zhǎng)，通道長(zhǎng)度和潛在結(jié)合位點(diǎn)增加。因此，我們認(rèn)為該結(jié)合位點(diǎn)主要負(fù)責(zé)CDA-3與Aβ_1-40靶向結(jié)合。當(dāng)CDA-3與Aβ_1-40聚集體結(jié)合時(shí)，熒光強(qiáng)度增加，表明CDA-3與Aβ_1-40聚集體之間存在明顯的相互作用(圖1h)。

圖1 (a和b)基于供體-受體-供體骨架的探針化學(xué)結(jié)構(gòu)。(c) croconate染料的共振結(jié)構(gòu):雙自由基和中離子型。(d)在水相B3LYP/6-31G (d, p)水平上對(duì)CDA-3進(jìn)行幾何優(yōu)化后的電荷分布。(e) CDA-3的紫外-可見(jiàn)吸收曲線(xiàn)。(f) CDA-3與Aβ_1-40纖維的分子對(duì)接結(jié)果。(g) CD-3在A(yíng)β原纖維上的構(gòu)象。(h) CDA-3和CDA-3與Aβ_1-40聚集體相互作用時(shí)的熒光強(qiáng)度。

作者評(píng)價(jià)了croconium染料作為一種新的PA造影劑成像大腦中的Aβ斑塊。將CDA-3的PA性能與吲哚菁綠(ICG)、普魯士藍(lán)(PB)和金納米棒(GNRs)等常用探針進(jìn)行了比較。所有這些染料的吸收峰都落在近紅外窗口(圖2a)。用808 nm激光(1.0 W cm^-2)，CDA-3溶液的溫度從26℃迅速上升到63℃。在NIR激光照射下，溶液的紫外(UV)吸光度沒(méi)有明顯的變化。在相同的條件下，GNRs和PB產(chǎn)生的升溫幅度較小(從27到40℃) (Fig. 2 b和2c)?；ㄝ既玖?如ICG)有明顯的缺點(diǎn)，如光漂白和熱效應(yīng)隨時(shí)間的增加而損失(圖2c)。相比之下，ICG在CDA中沒(méi)有同時(shí)出現(xiàn)明顯的吸收光譜變化。CDA作為一種具有優(yōu)良光熱效應(yīng)的近紅外有機(jī)染料，在800 nm脈沖激光照射下可以有效地產(chǎn)生PA信號(hào)(圖2d)。圖2f顯示了CDA對(duì)PA信號(hào)的依賴(lài)性與濃度的關(guān)系。此外，我們將CDA與三種具有代表性的探針I(yè)CG、PB和GNRs進(jìn)行了PA性質(zhì)的比較。在相同濃度下，CDA提供的PA信號(hào)強(qiáng)度最高分別是ICG、PB和GNR的1.4倍、1.5倍和4.5倍(圖2e)。利用人神經(jīng)細(xì)胞(SH-SY5Y)進(jìn)行MTT試驗(yàn)，研究CDA-3的生物相容性。圖2 h顯示，即使在相對(duì)較高的濃度0.5 mg mL^-1, CDA-3的細(xì)胞毒性也可以忽略不計(jì)。

圖2 (a) ICG、PB、GNR和CDA-3在水溶液中的吸收光譜。(b) 808 nm激光照射下ICG、PB、GNR、CDA-3和水的光熱成像(1 W cm^-2、10分鐘)。(c) (b) (d)不同濃度(1,0.5, 0.25, 0.125, 0.063, 0.031, 0.016, 0.008 mg mL^-1)的CDA-3的PA成像曲線(xiàn)。(e) 808 nm激光照射(1 W cm^-1、10分鐘)。(f) PA信號(hào)強(qiáng)度與濃度的函數(shù)關(guān)系。(g)激光照射前后PA信號(hào)強(qiáng)度。(h)不同濃度的CDA-3與人神經(jīng)元細(xì)胞系(SH-SY5Y)的細(xì)胞毒性

作者探討了CDA-對(duì)腦血管中Aβ斑塊特異性標(biāo)記。對(duì)甲醛固定的WT(野生型)和Tg小鼠的腦切片進(jìn)行第一次Aβ抗體(6E10)染色，Tg小鼠的腦切片很容易被6E10標(biāo)記。CDA-3染色的Tg老鼠和AD病人的大腦血管中的Aβ沉積和纖維化與硫磺素染色 (Th-S)非常吻合(圖3 a和d)。WT老鼠的大腦部分沒(méi)有被明顯標(biāo)記。為了進(jìn)一步檢查血管上CDA-3對(duì)陽(yáng)性Aβ斑塊的影響，作者使用血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)標(biāo)記物(phalloidin-Alexa 594)對(duì)石蠟包埋的大腦切片進(jìn)行染色。如圖3b和c所示，Tg小鼠血管中的Aβ沉積被VSMC標(biāo)記物清楚地標(biāo)記出來(lái)。

圖3體外用CDA-3對(duì)(a) Tg小鼠和(d) Cy5.5過(guò)濾網(wǎng)的人腦組織切片進(jìn)行Ab斑塊的熒光染色。(b)用Alexa 594濾鏡對(duì)Tg小鼠的血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行phalloidin染色。(c)高倍圖像顯示血管段VSMC層排列嚴(yán)重破壞。用Th-S (a-d)標(biāo)記同一切片上斑塊的存在和分布。(a)、(b)、(d)中的比例尺為100 mM，(d)中的比例尺為50mM。

作為一種近紅外熒光染料，使用不同的腦組織覆蓋層(0, 1, 2, 3 mm)檢測(cè)CDA-3的穿透深度(圖4a-c)。隨著腦組織厚度的增加，熒光強(qiáng)度明顯減弱，但在3mm處仍可檢測(cè)到，熒光強(qiáng)度的定量分析如圖4d所示。為了檢測(cè)CDA-3染料在體內(nèi)的生物分布，我們進(jìn)行了NIRF成像，尾靜脈注射0.1 mg mL^-1的CDA-3給阿爾茨海默病(5-FAD)和WT小鼠。從圖4e和圖4f可以看出，5-FAD和WT組。注射后4小時(shí)，5 -FAD組腦組織可見(jiàn)最大強(qiáng)度的熒光(圖4g)。然而，在WT組中，CDA-3的生物分布顯示了一個(gè)可以忽略的大腦保留，這表明游離染料很快從體內(nèi)被清除(圖4e)。這些結(jié)果表明高熒光信號(hào)在5-FAD小鼠可歸因于CDA-3染料和β-淀粉樣斑塊之間的特異性結(jié)合能力。

圖4大腦CDA熒光成像檢測(cè)穿透深度。(a)白光;(b) CDA-3熒光成像;(c)熒光成像;(e) Tg小鼠和(f) WT小鼠靜脈注射CDA-3 (0.5 mg kg^-1)后不同時(shí)間點(diǎn)(0、1、4、8 h)的NIRF圖像。(g)定量Tg和WT小鼠代表性時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

與熒光成像不同，PA成像可以通過(guò)超聲波打破強(qiáng)光學(xué)散射，同時(shí)保持較高的穿透深度和空間分辨率。由于CDA-3在體外具有良好的PA性能，我們隨后在CAA模型中研究了體內(nèi)PA成像。圖5顯示了¹⁸F標(biāo)記的 CDA-3注射后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠大腦的PA圖像。從PA成像結(jié)果可以看出，在注射后1小時(shí)，功能化染料在CAA模型中比對(duì)照組積累得更好。在給藥4小時(shí)后，CDA-3的PA信號(hào)在Tg組的腦血管中顯示明顯的增強(qiáng)，提示高Aβ結(jié)合(圖5a)。WT組的PA信號(hào)幾乎與之前相同(圖5c)。為了進(jìn)一步突出腦區(qū)，我們將不同時(shí)間點(diǎn)的PA圖像減去注射藥物前的原始PA圖像，進(jìn)行差分PA成像。如圖5b所示，通過(guò)比較Tg組注射前和注射4h后的PA信號(hào)，可見(jiàn)矢狀竇的增強(qiáng)PA圖像對(duì)比度顯著。而WT組在不同時(shí)間點(diǎn)的PA信號(hào)沒(méi)有明顯變化(圖5d)。這些結(jié)果表明，CDA-3復(fù)合物具有強(qiáng)大的能力，可以提高斑塊增強(qiáng)成像對(duì)CAA的診斷價(jià)值。

圖5 (a) Tg和(c) WT小鼠靜脈注射[18F]CDA-3后不同時(shí)間點(diǎn)PA最大振幅投影圖像。(b) Tg和(d) WT組小鼠大腦PA信號(hào)增強(qiáng)。(e) Tg和WT小鼠大腦中¹⁸F CDA-3的PA信號(hào)強(qiáng)度(左Y軸)和指定時(shí)間點(diǎn)PA(Tg)/PA(WT)的值(右Y軸)。

隨著PET技術(shù)在臨床中廣泛應(yīng)用于全身成像，作者探索了基于¹⁸F的PET方法作為一種輔助成像技術(shù)。我們通過(guò)尾靜脈注射了185 MBq/62.5 mg劑量的 ¹⁸F CDA-3。從圖6a中可以看出， Tg小鼠大腦中¹⁸F CDA-3分布清晰。由于缺乏Ab斑塊，WT小鼠的大腦中很少有特異性結(jié)合。由于淀粉樣蛋白特異性示蹤劑， ¹⁸F CDA-3 PET顯示Tg小鼠的腦血管攝取率約為WT組的2倍(圖6b)。由于PET沒(méi)有組織穿透限制，在給藥¹⁸F CDA-3后的1小時(shí)內(nèi)，通過(guò)全小鼠獲得了0.9 mm厚的連續(xù)冠狀切片(圖6c)。然而，發(fā)現(xiàn)¹⁸F CDA-3顯著尿化，Tg小鼠的斷層成像顯示¹⁸F CDA-3在腦內(nèi)的三維分布明顯，而不是WT組的低腦積累。綜上所述，¹⁸F CDA-3是一種用于體內(nèi)CAA監(jiān)測(cè)和早期診斷的PET探針。

圖6 (a)小鼠的多示蹤PET成像。Tg小鼠被¹⁸FAV-45和[18F]CDA-3 PET/CT排除，表明Aβ在大腦中聚集。¹⁸F FDG PET/CT顯示Tg小鼠代謝低下。而WT小鼠正常，無(wú)Aβ沉積。(b) Tg和WT組對(duì)¹⁸F CDA-3的腦攝取。(c) Tg和WT小鼠¹⁸F CDA-3的全身PET成像。

結(jié)論

本研究探索了croconium克酮酸染料作為PET/PA/NIR熒光三模成像配體對(duì)腦斑塊的選擇性親和性。CDA-3具有增強(qiáng)的近紅外吸收、有效的光熱特性、靈敏的PA反應(yīng)以及全身PET成像等優(yōu)點(diǎn)，在腦血管淀粉樣蛋白監(jiān)測(cè)方面發(fā)揮著重要作用，將為制定有效的CAA等腦血管疾病防治策略提供有力支持，將有助于研究大腦疾病的潛在機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

Yajing Liu, Yanping Yang, Mingjian Sun, Mengchao Cui, Ying Fu, Yu Lin, Zijing Li*, Liming Nie*, Highly specific noninvasive photoacoustic and positron emission tomography of brain plaque with functionalized croconium dye labeled by a radiotracer, Chem. Sci., 2017, 8, 2710. DOI: 10.1039/c6sc04798j. https://pubs.rsc.org/en/content/articlepdf/2017/sc/c6sc04798j

產(chǎn)品提供

放射性標(biāo)記的Croconium克酮酸染料

外觀(guān)：粉末黑色，溶液紫紅色

純度：95%以上

溶解性：脂溶性 DMSO DMF 等溶解

保存條件:-20度 避光 保存

備注：相關(guān)檢測(cè)/圖譜均有提供。

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