內(nèi)容提要

光聲(PA)成像已經(jīng)成為一種可靠的體內(nèi)技術(shù)，用于從疾病篩選到分析傳感的各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。大多數(shù)當(dāng)代PA顯像劑采用NIR-I光(650 - 900 nm)來產(chǎn)生超聲信號(hào)，然而，內(nèi)源性生物分子如血紅蛋白會(huì)產(chǎn)生明顯的干擾。向更長的激發(fā)波長(即NIR-II)過渡可以減少背景，促進(jìn)低含量目標(biāo)分子如NO)的檢測。作者采用開發(fā)了一種NIR II NO-響應(yīng)探針APNO-1080，可用于深層組織PA成像。首先，作者進(jìn)行了Hammett和Br?nsted分析，確定一種高度反應(yīng)性和選擇性的苯胺基接受器，通過N-硝化化學(xué)與NO反應(yīng)。在原位乳腺癌模型和異位肺癌模型中評(píng)估了APNO-1080在體內(nèi)的深層組織成像能力。

前言

光聲(PA)成像是一種強(qiáng)大的體內(nèi)技術(shù)，利用PA效應(yīng)將吸收光轉(zhuǎn)換為超聲信號(hào)。由于臨床上相關(guān)頻率(2 ~ 18 MHz)的聲音可以在最小擾動(dòng)下很容易地通過組織傳播，PA成像已成為各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的通用方法。在分析物傳感的背景下，多種設(shè)計(jì)策略已被用于開發(fā)聲源探針(也稱為可活化PA探針)，以選擇性地可視化和監(jiān)測體內(nèi)不同的成像目標(biāo)，如檢測缺氧、氧化還原狀態(tài)、酶活性、金屬離子、生物硫醇和各種活性氧和氮(ROS/RNS)的光聲探針。大多數(shù)小分子PA探針設(shè)計(jì)在NIR-I染料平臺(tái)上，其吸光度最大值在650 - 900 nm之間。一些內(nèi)源性的生物分子如血紅蛋白、氧血紅蛋白、脂質(zhì)和黑色素在這個(gè)區(qū)域吸收，導(dǎo)致高背景。除了不良的信號(hào)，這些生物發(fā)色團(tuán)衰減入射光，從而限制靈敏度和成像深度。作者報(bào)道的第一代NIR光聲探針(APNO-5)和第二代NIR光聲探針(SR-APNO-3)，它們能在活鼠中檢測一氧化氮(NO)，但是均局限于炎癥和乳腺癌的皮下模型。在NIR-II區(qū)域(>1000 nm)吸收的PA探針可以克服這些限制，提高信噪比，提高靈敏度和更深的組織穿透。本文發(fā)展了APNO1080并用于深層組織NO的 NIR-II PA成像。

結(jié)果與討論

通過具有不同取代位的苯胺（對(duì)位分別是?Br，?H，?CH₂OH，?Et，?Me，?OEt和?OMe)與Cy7-Cl反應(yīng)，獲得探針1?7(圖1a)。相應(yīng)的Hammett圖顯示ρ值為?0.94，這與在過渡態(tài)積累的適度正電荷特征一致，這是由增加的電子密度促進(jìn)的(圖1b)。從的Br?nsted圖中觀察到苯胺的共軛酸的pKa和反應(yīng)的初始速率之間有很強(qiáng)的相關(guān)性(R²= 0.87，圖1c)。探針7在不到30秒的時(shí)間內(nèi)促進(jìn)了NO的接近完全轉(zhuǎn)化(25°C, 100等量)。作者將接收器連接在三個(gè)商用的NIR-II花菁(IR-26、IR-1061和IR-1048)以及Et-108032和FlavV7上合成了8?12個(gè)探針(圖1d)。該系列的每個(gè)化合物都有一個(gè)大的消光系數(shù)(約為10⁵M^?1cm^?1)，在近紅外II窗口中吸光度最大。但是，這并不是影響PA信號(hào)強(qiáng)度的唯一因素。探針8、9和12在緩沖溶液體系中都很難溶解，這導(dǎo)致了較弱的PA信號(hào)。探針10和11在水介質(zhì)中具有清晰明確的光譜特性，并且在照射后具有明顯更強(qiáng)的PA信號(hào)。當(dāng)NO過量時(shí)， 10和11反應(yīng)完全。探針10(APNO-1080)能快速轉(zhuǎn)化為N-亞硝化產(chǎn)物，最大吸光度從874 nm轉(zhuǎn)移到1080 nm，紅移206 nm(圖2a)。APNO-1080及其N-亞硝化產(chǎn)物的連續(xù)輻照不會(huì)導(dǎo)致任何光氧化或光反硝化作用(圖2b)。作者首先檢測了APNO-1080 NIR-II光聲探針對(duì)NO的選擇性。在任何情況下，作者都沒有觀察到任何不希望的探針激活(圖2c)。此外，作者進(jìn)行了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的MTTA549細(xì)胞在25 μM濃度下培養(yǎng)24小時(shí)無細(xì)胞毒性(圖2d)。將APNO-1080與富含CYP450酶的大鼠肝微粒體(RLM)在37°C孵育1 h，檢測其代謝穩(wěn)定性。APNO-1080在1080 nm處的吸光度沒有增加，說明有RLM存在時(shí)APNO-1080是穩(wěn)定的。

圖1. (a)不同NIR-I APNOs(探針1?7)與NO反應(yīng)生成N-亞硝基產(chǎn)物的示意圖。(b) 25℃下對(duì)取代APNOs和NO(引入為MAHMA-NONOate)的N-亞硝化反應(yīng)的Hammett圖。虛線表示最佳線性擬合。R² = 0.94。(c) Br?nsted圖，表示log(k)與每個(gè)苯胺的共軛酸形式的pk_a值之間的線性關(guān)系。虛線表示最佳線性擬合。R² = 0.87。(d)來自IR-26、IR-1061、IR-1048、Et-1080和Flav7的NIR-II APNOs(探針8?12)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖2. (a) APNO-1080經(jīng)(紅色)和(藍(lán)色)NO處理后的歸一化吸收光譜。(b)的耐光性試驗(yàn)APNO-1080或N-nitrosated產(chǎn)品(50 μM)連續(xù)與脈沖激光輻照在各自的最大吸收處300秒。(c)反應(yīng)APNO-1080 (5 μM)與生物相關(guān)的金屬離子(1 mM),谷胱甘肽(1 mM),半胱氨酸(500 μM),硫化氫(100 μM)、活性氧(1 mM)，活性羰基 (1 mM)，活性氮(1 mM)，ONOO^?(50 μM)和NO (100 μM)孵育1 h后。(d) 37°C培養(yǎng)24 h后A549細(xì)胞毒性。

作者比較了APNO-1080和探針7(APNO-780)的深層組織能力。每個(gè)探針的溶液都用NO供體(MAHMA-NONOate)處理以確保完全激活。將得到的產(chǎn)品嵌入由瓊脂糖和2%牛奶組成的3厘米厚的模擬組織中，在吸光度最大處成像。APNO-1080可以清晰地觀測到，而APNO-780在背景中無法識(shí)別(圖3b)。當(dāng)根據(jù)波長依賴性的影響差異進(jìn)行校正時(shí)，相當(dāng)于靈敏度增加了17.7倍(圖3c)。兩個(gè)探針的PA強(qiáng)度相似，表明激發(fā)光的穿透增加是導(dǎo)致靈敏度差異的原因。這是一個(gè)近似效果，因?yàn)槟M的組織缺乏血紅蛋白和氧血紅蛋白，活體中減弱NIR-I光比NIR-II光更明顯(圖3a)。

圖3. (a)與NIR-I光相比，NIR-II光能更深地穿透組織的示意圖。(b) APNO-780和APNO-1080代表性PA圖像(10 μM)經(jīng)NO處理后，覆蓋3cm厚組織成像圖。(c)量化數(shù)據(jù)來自(b).誤差條= SD (n = 3)采用雙尾Student’s t檢驗(yàn)(α = 0.05)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。****: p < 0.0001。

檢測與癌癥相關(guān)的內(nèi)源性NO對(duì)于理解其在調(diào)節(jié)**微環(huán)境中的作用至關(guān)重要。APNO-1080首次應(yīng)用于原位4T1-Luc乳腺癌模型。與作者之前皮下乳腺癌模型相比，由此產(chǎn)生的原位**可以生長到體內(nèi)更深處，是評(píng)估APNO-1080在體內(nèi)深層組織成像能力的理想模型。表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞系用來確認(rèn)植入和跟蹤**生長。當(dāng)**體積增長到約400 mm³時(shí)，給藥APNO-1080后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行成像，并使用光譜分離來自探針的信號(hào)。作者觀察到荷瘤小鼠的激活反應(yīng)為1.3±0.1倍，而無**對(duì)照小鼠的激活反應(yīng)為1.0±0.2倍(圖4a,b,e)。我們將A549-Luc2肺癌細(xì)胞移植到Nu/J小鼠的肝臟上，模擬肺癌患者的肝轉(zhuǎn)移，并提供更深組織中成像NO的可能性。植入后幾周使用生物發(fā)光成像檢測**，然后通過眼球注射APNO-1080進(jìn)行PA成像。30分鐘后進(jìn)行實(shí)時(shí)PA監(jiān)控，觀察到一個(gè)明顯信號(hào)增加**區(qū)域。

圖4. (a) (b)圖像橫斷面解剖的卡通示意圖。(b) 4T1-Luc**的代表性PA圖像，以及APNO-1080 (50 μM)治療后的無**對(duì)照。(c) (d) A549-Luc2**的代表性PA圖像，以及APNO-1080治療后的無瘤對(duì)照。(e) APNO-1080治療后4T1-Luc**的PA折疊正?；?。(f) APNO-1080治療后A549**的歸一化PA折疊開啟(n = 6)和非**對(duì)照(n = 3)。錯(cuò)誤條= SD。采用雙尾Student 's t檢驗(yàn)(α = 0.05)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。***: p < 0.001

結(jié)論

作者成功地開發(fā)了第一個(gè)NIR-II光聲探針APNO-1080，用于檢測深層組織中內(nèi)源性癌癥來源的NO。APNO-1080在NIR-II花菁平臺(tái)(IR-1048)上具有優(yōu)化的對(duì)甲氧基苯胺接受器。與NO反應(yīng)后，N-亞硝化產(chǎn)物的消光系數(shù)在1080nm處吸收最大，與探針的光譜無重疊，能夠靈敏地檢測**中穩(wěn)定濃度在低nM范圍內(nèi)的NO。本研究強(qiáng)調(diào)了將PA造影劑和光聲探針移至NIR-II窗口以獲得更大的成像深度和更高的靈敏度的價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

Melissa Y. Lucero, Amanda K. East, Christopher J. Reinhardt, Adam C. Sedgwick, Shengzhang Su, Michael C. Lee, Jefferson Chan*, Development of NIR-II Photoacoustic Probes Tailored for Deep-Tissue Sensing of Nitric Oxide, J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 7196?7202， DOI：10.1021/jacs.1c03004. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c03004.

產(chǎn)品提供

NO近紅外1區(qū)/2區(qū)熒光/光聲探針