內(nèi)容提要

近年來，活細(xì)胞中一氧化碳(CO)的熒光檢測(cè)備受關(guān)注。由于缺乏有效的構(gòu)建CO熒光探針的方法，活細(xì)胞中CO的熒光檢測(cè)仍處于起步階段。本文首次報(bào)道以烯丙基醚為反應(yīng)位點(diǎn)構(gòu)建CO熒光探針的方法。通過這種方法制備了兩種易獲得的烯丙基熒光素醚，它們是在PdCl₂存在下對(duì)CO具有高度選擇性和敏感性的探針。這些探針具有穩(wěn)定性好、水溶性好、比色性好、熒光開啟信號(hào)變化顯著等優(yōu)點(diǎn)，可以用很低的劑量檢測(cè)和跟蹤活細(xì)胞中的CO，有望成為生物系統(tǒng)中檢測(cè)CO非常有前途的生物工具。

前言

一氧化碳(CO)可以在人體的血紅素分解代謝過程中內(nèi)源性產(chǎn)生，它已被證明是一種重要的細(xì)胞信號(hào)分子，可以保護(hù)我們免受血管疾病、炎癥甚至癌癥的傷害，引起了對(duì)CO的前所未有的關(guān)注。隨著CO在生物學(xué)中的研究不斷深入，開發(fā)選擇性、靈敏的方法實(shí)時(shí)跟蹤生命系統(tǒng)中的這種小氣體分子具有重要的科學(xué)意義。由于熒光檢測(cè)方便、靈敏度高、實(shí)時(shí)無損檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而倍受青睞。CO熒光探針的構(gòu)建仍處于很早期的階段，目前報(bào)道CO熒光探針主要使用遺傳編碼蛋白和有機(jī)鈀配合物，要么需要大量復(fù)雜的加工，要么難以合成，響應(yīng)時(shí)間較長(30 ~ 60分鐘)，因此迫切需要開發(fā)新的方法來構(gòu)建具有優(yōu)良傳感性能的一氧化碳熒光探針。作者最近使用了廉價(jià)、高熒光熒光素和眾所周知的Pd(0)介導(dǎo)的Tsuji-Trost反應(yīng)，開發(fā)了一種易于獲得的CO熒光開啟探針(FL-CO-1)，該方法對(duì)CO具有良好的傳感性能，可方便地用于活細(xì)胞中CO的檢測(cè)。由于碳酸烯丙基保護(hù)基團(tuán)的穩(wěn)定性不夠，FL-CO-1的穩(wěn)定性不是很好。為了解決這個(gè)問題，作者研究了第二代以烯丙基醚為保護(hù)基團(tuán)和反應(yīng)位點(diǎn)的CO熒光素探針(探針1和探針2)。烯丙基醚相對(duì)于碳酸烯丙基更穩(wěn)定。烯丙基也很容易被Pd(0)介導(dǎo)的Tsuji?Trost反應(yīng)去除。這些烯丙基醚具有良好的穩(wěn)定性，可以方便地用于CO的體外和活細(xì)胞檢測(cè)，且性能優(yōu)良傳感特性，為設(shè)計(jì)CO熒光探針提供了一種新的方法。

結(jié)果與討論

作者首先將探針1和探針2與我們的第一代基于熒光素的CO探針(FL-CO-1)進(jìn)行了穩(wěn)定性比較。由于熒光素結(jié)構(gòu)的內(nèi)酯形式，探針1和探針2在PBS緩沖液中都是非熒光的。然而，探針FL-CO-1在PBS緩沖液中隨著時(shí)間的推移顯示出相當(dāng)大的熒光增強(qiáng)，這表明它對(duì)pH值很敏感)。此外，FL-CO-1對(duì)紫外光也很敏感。探針1和探針2在相同的條件下沒有顯示任何變化。探針1和2具有良好的穩(wěn)定性和優(yōu)良的光穩(wěn)定性，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于FL-CO-1。探針1和2對(duì)Pd²⁺沒有響應(yīng)，但對(duì)Pd(0)顯示出快速和顯著的熒光增強(qiáng)。考慮到Pd²⁺可以被CO原位快速還原為Pd(0)，因此，1和2可以作為CO的候選探針。以CORM-3為水溶性CO的緩釋劑，研究了探針1和探針2在PdCl₂存在下對(duì)CO的響應(yīng)。如圖1所示，添加CORM-3，5 μM探針+ 5 μM PdCl₂在PBS緩沖(10 mM，pH值7.4)顯示快速熒光刺激反應(yīng)，在20分鐘內(nèi)，兩個(gè)探針的熒光強(qiáng)度的解決方案都增強(qiáng)了150倍。因此，在探針1和探針2的溶液中都可以觀察到強(qiáng)烈的黃綠色熒光(圖1a和c)。因此探針1和探針2都可以作為熒光探針在溫和的條件下快速檢測(cè)水溶液中的CO。

圖1。在37℃PBS緩沖液(10 mM, pH 7.4)中加入CORM-3 (100 μM)后，探針體系(5 μM探針+ 5 μM PdCl₂)的熒光光譜發(fā)生變化。(a)添加CORM-3后的探針1。(b)探針1在516 nm處的熒光強(qiáng)度比F/F₀隨時(shí)間的變化。(c)添加CORM-3后的探針2。(d)探針2在527 nm處的熒光強(qiáng)度比(F/F₀)隨時(shí)間的變化。在365 nm的光下，發(fā)射光譜的顏色變化分別插入(a)和(c)。

在探針1和探針2溶液中加入不同濃度的CORM-3。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，加入CORM-3 (10 ~ 400 μM)后，1和2的反應(yīng)均順利進(jìn)行，產(chǎn)生劑量和時(shí)間依賴性的熒光增強(qiáng)。在熒光光譜的變化中，隨著CORM-3濃度的逐漸增加，兩種探針溶液的熒光均呈逐漸增加的趨勢(shì)大約520 nm，直到逐漸接近飽和。探針的熒光變化和CORM-3濃度(0?50 μM)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(圖2)。探針1和2的檢測(cè)限分別為46 nM(～1.3 ppb)和29 nM (～0.8 ppb)。

圖2。(a)添加不同濃度的CORM3 (0 ~ 50 μM)后探針1 (探針1 + PdCl₂，各5 μM)的熒光光譜變化。(b)探針1在516 nm處的熒光強(qiáng)度隨0 ~ 50 μM濃度的變化呈線性關(guān)系。(c)加入不同濃度的CORM-3 (0 ~ 50 μM)后，探針2 (探針2 + PdCl2，各5 μM)的熒光光譜變化。(d)探針2在527 nm處的熒光強(qiáng)度隨0 ~ 50 μM濃度的變化呈線性關(guān)系。所有數(shù)據(jù)采集于PBS緩沖液(10 mM, pH 7.4)中，37℃，混合20 min后獲得各光譜。

選擇性的探針1和2對(duì)近40種不同分析物包括常見的陰離子，如F^-，Cl^?，Br^?，AcO^?，HCO₃^?,N₃^?，NO₃^?,SO₄^2?, HSO₄^?，HSO₃^?,HS^?, SCN^?，CN^?，ClO₄^?，IO₄^?，P O₄^3?，HPO₄^2?，生物硫醇如Cys、Hcy、GSH，氨基酸如Ser，Trp，Ala，Phe，Gln，Glu，Lys，Leu，Gly和Ile，以及活性氧/氮(ROS/RNS)，如ClO^?，H₂O₂，NO₂^?，NO，HNO，ROO?，tBuOO?和?OH。如圖3所示，只有添加CORM-3時(shí)，探針1和探針2溶液的熒光增強(qiáng)效果顯著，而其他分析物的熒光增強(qiáng)效果幾乎為0。探針1和2系統(tǒng)對(duì)CO都具有高度選擇性。

圖3。探針1和探針2溶液對(duì)不同分析物(100 μM)的熒光光譜和熒光強(qiáng)度響應(yīng)。(a, b)探針1溶液(探針1 + PdCl₂各5 μM)。(c, d)探針2溶液(探針2+PdCl₂，各5 μM)。各種分析物(1)SO₄^2?,(2)HSO₄^?，(3)HSO₃^?,(4) AcO?,(5)F^?, (6) Cl^?, (7)Br^?, (8)I^-, (9)ClO^?, (10)IO₄^?, (11)ClO₄^?, (12) NO₃^-, (13)SCN^?, (14) CN^?, (15)N₃^?, (16) HCO₃^?, (17) ROO?, (18) NO,(19)H₂O₂, (20)tBuOO?, (21) HNO,(22)?OH, (23) HS^?, (24)Cys, (25)Hcy, (26) GSH,(27)Ser, (28) Trp, (29)Ala, (30)Phe, (31)Gln, (32) Glu (32), (33) Lys, (34) Leu, (35) Gly, (36) Ile, (37) Pd²⁺, (38) CORM-3。在37°C PBS緩沖液(10 mM, pH 7.4)中混合20分鐘后監(jiān)測(cè)所有光譜。

兩種CO探針系統(tǒng)的光學(xué)變化均顯示出相應(yīng)的高熒光熒光素的形成。為了證實(shí)這一點(diǎn)，探針1和2的反應(yīng)混合物受到質(zhì)量和TLC分析。反應(yīng)混合物的質(zhì)量分析(探針1+PdCl₂+CORM-3) ，5分鐘表現(xiàn)出明顯的峰值為333.0779，說明反應(yīng)確實(shí)產(chǎn)生了熒光素。合成單烯丙基熒光素醚并作為薄層色譜分析的參考樣品，TLC分析結(jié)果清楚地表明，該反應(yīng)經(jīng)過了一個(gè)單烯丙基醚中間體，然后轉(zhuǎn)化為熒光素作為最終產(chǎn)物。探針2的反應(yīng)混合物的質(zhì)量和薄層色譜分析也可以得到類似的結(jié)果。這些結(jié)果表明，探測(cè)系統(tǒng)對(duì)CO的傳感機(jī)制圖下圖所示。

圖4。探針1和2檢測(cè)CO的傳感機(jī)制

受其溶液條件下優(yōu)異性能的鼓舞，研究了探針1和探針2在活細(xì)胞CO成像中的潛在應(yīng)用。MTT分析表明，探針1系統(tǒng)對(duì)活細(xì)胞具有極低的細(xì)胞毒性；甚至可以達(dá)到50 μM。探針2系統(tǒng)對(duì)活細(xì)胞顯示了一定程度的細(xì)胞毒性，這可能是由于鹵素原子的存在。由于探針1和探針2都是高度敏感的，我們可以使用探針在很低的劑量(1μM)對(duì)活細(xì)胞中的CO進(jìn)行熒光成像。圖5結(jié)果表明，用1 μM探針1對(duì)活HeLa細(xì)胞中的CO進(jìn)行成像?？梢钥吹剑?dāng)HeLa細(xì)胞與探針1或探針1與PdCl₂(每個(gè)探針1 μM)孵育30分鐘時(shí)，沒有觀察到熒光(圖5A1,B1)。當(dāng)細(xì)胞用CORM3預(yù)孵育，然后用探針系統(tǒng)孵育(探針1+PdCl₂，各1 μM)時(shí)，觀察到劑量依賴性的細(xì)胞內(nèi)熒光(圖5C1?E1)。當(dāng)探針2的探針尺寸為1 μM時(shí)，可以觀察到類似的結(jié)果。探針1和探針2都可以用于檢測(cè)活細(xì)胞中的CO。

圖5. 利用探針1系統(tǒng)(探針1 + PdCl₂，每個(gè)探針1 μM)對(duì)HeLa細(xì)胞中的CO進(jìn)行熒光成像。A?E:亮場圖像。最底層A1?E1: A?E的熒光圖像，激發(fā)波長為450 ~ 480 nm。(A1)細(xì)胞孵化與探針1(1 μM) 30分鐘。(B, B1)細(xì)胞孵化與探針1和PdCl2(1μM) 30分鐘。(C和C, D和D1, E和E1)細(xì)胞preincubated 1、5和10μM的CORM-3 30分鐘,然后用探針1和PdCl₂(1 μM) 30分鐘,分別。比例尺= 20 μm。

在活細(xì)胞中，血紅素可以刺激更多的血紅素加氧酶(HO)衍生的CO，我們也研究了探針1和2檢測(cè)血紅素處理后內(nèi)源性CO的能力。如圖6所示，當(dāng)細(xì)胞與血紅素在探針1和PdCl₂的混合物(各1 μM)孵育前，細(xì)胞顯示時(shí)間依賴性的熒光增強(qiáng)(圖6A1?C1)。這說明血紅素處理內(nèi)源性CO產(chǎn)生的過程可以通過探針1跟蹤。如果使用探針2，可以觀察到類似的結(jié)果。因此，這些結(jié)果表明探針1和探針2對(duì)內(nèi)源性CO有很大的成像潛力。

圖6。利用探針系統(tǒng)(探針1 + PdCl₂)對(duì)HeLa細(xì)胞中亞鐵血紅素刺激產(chǎn)生的CO進(jìn)行熒光成像。上行A?C和下行A1?C1分別為亮場圖像和相應(yīng)的熒光圖像，激發(fā)波長為450 ~ 480 nm。100 μM血紅素預(yù)孵育1 h (A, A1)、5 h (B, B1)和10 h (C, C1)，然后分別用探針系統(tǒng)(探針1 + PdCl₂，各1 μM)孵育30 min。比例尺= 20 μm。

結(jié)論

作者首次報(bào)道了將烯丙基醚作為反應(yīng)位點(diǎn)開發(fā)出兩種新的CO熒光探針。這兩種CO探針表現(xiàn)出比我們最近報(bào)道的基于烯丙基碳酸酯的CO熒光探針更好的穩(wěn)定性，更重要的是，在PdCl₂的存在下，這兩種探針對(duì)CO都表現(xiàn)出了良好的傳感性能。它們還可以方便地用于活細(xì)胞中CO的成像。本研究不僅提供了兩種新的有前途的CO熒光探針，而且為開發(fā)有效的用于活細(xì)胞CO檢測(cè)的熒光探針提供了新的思路。

參考文獻(xiàn)

Shumin Feng, Dandan Liu, Weiyong Feng, Guoqiang Feng*, Allyl Fluorescein Ethers as Promising Fluorescent Probes for Carbon Monoxide Imaging in Living Cells, Anal. Chem. 2017, 89, 3754?3760. DOI: 10.1021/acs.analchem.7b00135. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.7b00135

產(chǎn)品提供

CO熒光探針