內(nèi)容提要

創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是一種發(fā)病率高、死亡率高的急性病。目前早期診斷和對(duì)病理過(guò)程的實(shí)時(shí)反饋的方法仍然有限。本文提出了一種第二近紅外窗口(NIR-II)的靶向可激活熒光納米探針(v&A@Ag₂S)用于TBI的體內(nèi)光學(xué)成像。V&A@Ag₂S的熒光由于能量從Ag₂S轉(zhuǎn)移到A1094發(fā)色團(tuán)而被關(guān)閉。經(jīng)靜脈注射后，V&A@Ag₂S基于VCAM1介導(dǎo)的吞噬作用在TBI的炎癥血管內(nèi)皮中迅速積累，由于A1094被TBI的前驅(qū)生物標(biāo)志物過(guò)氧亞硝酸鹽(ONOO^-))漂白，納米探針實(shí)現(xiàn)了Ag₂S量子點(diǎn)NIR-II熒光的快速恢復(fù)。該納米探針對(duì)ONOO^-具有高特異性、快速響應(yīng)和高靈敏度，為TBI的體內(nèi)早期實(shí)時(shí)評(píng)估提供了方便的方法。

前言

創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是人類(lèi)死亡和殘疾的一個(gè)重要原因。由于創(chuàng)傷性腦損傷的繼發(fā)性損傷包括炎癥、血腦屏障(BBB)破壞、氧化應(yīng)激、缺氧和缺血等往往是隱形的，因此實(shí)現(xiàn)早期實(shí)時(shí)診斷和有效干預(yù)的方法是成功的TBI治療的關(guān)鍵。計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)和磁共振成像(MRI)是經(jīng)常用于TBI診斷的體內(nèi)成像方式，它們主要檢測(cè)器官的解剖和功能變化，而在檢測(cè)TBI基礎(chǔ)的早期分子水平變化方面用處不大。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)高靈敏度的新方法來(lái)實(shí)現(xiàn)TBI的原位早期實(shí)時(shí)診斷和治療評(píng)估。熒光成像技術(shù)由于其快速反饋、多信號(hào)采集、高靈敏度和不存在電離輻射等固有特性，是實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生物體疾病發(fā)生和發(fā)展的特別有利的方法。第二近紅外窗口(NIR-II, 1000-1700 nm)的熒光成像吸引了很多關(guān)注，因?yàn)樗哂袩o(wú)與倫比的組織穿透(幾厘米)和空間分辨率(約10毫米)，是下一代活體成像技術(shù)的首選。早期生物標(biāo)志物的識(shí)別和相關(guān)分子探針的開(kāi)發(fā)對(duì)TBI的早期診斷至關(guān)重要。腦血管系統(tǒng)的過(guò)氧亞硝酸鹽(ONOO^-)有助于顯著的創(chuàng)傷性腦損傷進(jìn)展，使其成為創(chuàng)傷性腦損傷的前驅(qū)生物標(biāo)志物。作者報(bào)道了一種新型靶向可激活NIR-II納米探針(V&A@Ag₂S)的設(shè)計(jì)和合成，用于TBI早期生物標(biāo)志物的實(shí)時(shí)體內(nèi)成像。由于A1094的吸收光譜與Ag₂S量子點(diǎn)的發(fā)射光譜有很大的重疊，在沒(méi)有ONOO^-的情況下，有效能量從Ag₂S量子點(diǎn)轉(zhuǎn)移到A1094的情況下，V&A@Ag₂S仍然處于“關(guān)”狀態(tài)；ONOO^-存在時(shí)，A1094被氧化，1094 nm處的吸收峰消失，因此，Ag₂S量子點(diǎn)被“打開(kāi)”，并在1050 nm處誘導(dǎo)熒光信號(hào)顯著上升。與VCAM1結(jié)合的肽結(jié)合使納米探針能夠在TBI區(qū)域?qū)Ρ磉_(dá)VCAM1的炎癥內(nèi)皮具有高的靶向能力。這種新型靶向可激活NIR-II納米探針具有未來(lái)臨床應(yīng)用的潛力。

結(jié)果與討論

V&A@Ag₂S的透射電子顯微鏡(TEM)顯示所制備的V&A@Ag₂S納米探針的高均勻性，平均核心尺寸為Ag₂S量子點(diǎn)直徑約3.3 nm。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測(cè)量表明，V&A@Ag2S納米探針在水溶液中的水動(dòng)力直徑(HD)為39.4 nm。在VHPK陽(yáng)離子肽表面附著后，納米探針的zeta電位由@52.5 mV提高到@2.8 mV。Ag₂S量子點(diǎn)具有典型的寬帶吸收和尖銳的NIR-II發(fā)射光譜。與A1094偶聯(lián)后，在1094 nm處出現(xiàn)了一個(gè)強(qiáng)烈的吸收峰，與Ag₂S量子點(diǎn)的發(fā)射有很大的重疊，保證了Ag₂S量子點(diǎn)與A1094之間的高效熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。作者通過(guò)記錄其對(duì)各種ROS/RNS的反應(yīng)來(lái)檢測(cè)探針的特異性。除了ONOO^-/ClO^-，沒(méi)有其他分析物激活V&A@Ag₂S的熒光，表明V&A@Ag₂S對(duì)ONOO@具有很強(qiáng)的特異性(圖1a,b)。在V&A@Ag₂S溶液(50 mg×mL^-1)中加入不同濃度的ONOO^-，V&A@Ag₂S在1050 nm處的熒光強(qiáng)度與ONOO^-的濃度呈線性關(guān)系，表明V&A@Ag₂S對(duì)ONOO^-的定量潛力巨大(圖1c,d)。V&A@Ag₂S對(duì)ONOO^-的動(dòng)態(tài)響應(yīng)在1秒內(nèi)完成，證明了ONOO^-檢測(cè)這一強(qiáng)大工具對(duì)其極短的半衰期的優(yōu)越性?？紤]到Ag₂S量子點(diǎn)在化學(xué)上是惰性的，作者研究了A1094與各種ROS/RNS/離子之間的相互作用，以確定參與這一過(guò)程的主要因素。為了鑒定添加ONOO^-后的A1094的氧化產(chǎn)物，采用HPLC-MS對(duì)最終產(chǎn)物進(jìn)行分析。其機(jī)理可以歸因于A1094與ONOO@的氧化反應(yīng)，之后共軛結(jié)構(gòu)被破壞，影響了電子轉(zhuǎn)移過(guò)程，導(dǎo)致1094 nm處特征A1094吸收峰消失。

圖1。a)不同ROS/RNS分析物和離子加入20 mm時(shí)，10 mg×mL^-1 V&A@Ag₂S的NIR-II熒光強(qiáng)度變化。b) ONOO^-逐漸加入A1094的吸收光譜(從0到21 mM)。插圖:1094 nm處的吸收強(qiáng)度與ONOO^-濃度的函數(shù)關(guān)系圖。c) V&A@Ag₂S在水溶液(50mg×mL^-1)中的光致發(fā)光回收率為ONOO^-濃度 (0-21 mm)的函數(shù)。d)在1050 nm處的熒光強(qiáng)度與ONOO^-濃度的關(guān)系圖。

由于VCAM1在多種炎癥性血管疾病的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并且已知VHPK多肽偶聯(lián)納米顆粒通過(guò)VCAM1介導(dǎo)的內(nèi)吞被攝取，作者首先確定了V&A@Ag₂S是否能夠有效內(nèi)化到炎癥性血管細(xì)胞中。作者用Cy7.5 (λ_em = 825 nm)標(biāo)記，并進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞成像處理。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)用TNF-a預(yù)處理12小時(shí)，然后與Cy7.5修飾的V&A@Ag₂S孵育1小時(shí)，使用熒光顯微鏡成像。如圖2a所示，在TNF-a處理的HUVECs中可以觀察到Cy7.5強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，而在未處理的HUVECs中熒光非常微弱。流式定量Cy7.5的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果血細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖2 b)。熒光免疫組化分析顯示TNF-a顯著增加了VCAM1的表達(dá)(圖2c)，表明V&A@Ag₂S可以通過(guò)VCAM1依賴(lài)的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸在炎癥內(nèi)皮細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高效內(nèi)化。

圖2。a) 熒光顯微鏡成像TNF-a處理的HUVECs和未處理的HUVECs與Cy7.5修飾納米探針在37°C孵育1小時(shí)。b)流式細(xì)胞術(shù)分析Cy7.5修飾納米探針預(yù)孵育的HUVECs。PBS孵育的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。c) HUVECs用TNF-a處理，并進(jìn)一步用VCAM1抗體染色(紅色)。比例尺= 50 mm。

為了進(jìn)一步揭示V&A@Ag₂S的細(xì)胞內(nèi)分布，采用共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)進(jìn)行熒光共定位成像。TNF-a預(yù)處理HUVECs10 mg×mL^-11V&A@Ag₂S 1 h，再用兩種典型細(xì)胞器探針LysoTracker (577/590 nm,溶酶體探針)和MitoTracker (490/510 nm，線粒體探針)，從而達(dá)到特定的成像的溶酶體和活細(xì)胞的線粒體。借助Cy7.5的熒光信號(hào)，V&A@Ag₂S的胞內(nèi)定位可以通過(guò)共焦成像很容易探測(cè)（圖3a,c）。Cy7.5和LysoTracker幾乎完全重疊(圖3b)，表明V&A@Ag₂S主要位于VCAM1介導(dǎo)的內(nèi)吞后的溶酶體中。

圖3。a) 將細(xì)胞與Cy7.5修飾的V&A@Ag₂S在378C孵育1小時(shí)，然后進(jìn)一步與LysoTracker、MitoTracker和Hoechst孵育。b) Cy7.5和LysoTracker的共定位圖像顯示這兩個(gè)通道之間存在大量重疊。c) 炎癥內(nèi)皮細(xì)胞三維熒光圖像。比例尺= 20 mm。

作者進(jìn)行了研究其用于細(xì)胞內(nèi)監(jiān)測(cè)的可行性ONOO^-的產(chǎn)生。為此，我們使用3-morpholinosydnonimine (SIN-1)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激在體內(nèi)模擬TBI生成ONOO^-。HUVECs與TNF-a預(yù)孵育，然后與V&A@Ag₂S再孵育1 h，然后用或不加SIN-1)刺激。如圖4a所示，在沒(méi)有ONOO^-的前體 SIN-1的情況下，用V&A@Ag₂S處理的HUVECs中沒(méi)有檢測(cè)到NIR-II熒光信號(hào)。相反，在SIN-1中，NIR-II熒光在30 min內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，表現(xiàn)出與時(shí)間相關(guān)的NIR-II熒光信號(hào)增強(qiáng)(圖4b)，從而表明納米探針的熒光恢復(fù)速度快，在ONOO活體中具有優(yōu)秀的快速實(shí)時(shí)檢測(cè)能力。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的抗Annexin V-FITC和PI雙染色以及流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估了V&A@Ag₂S對(duì)HUVECs、人骨間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)和小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在V&A@Ag₂S濃度為20-100 mg×mL^-1的情況下，細(xì)胞在孵育24 h后的存活率估計(jì)分別大于83%、91%和95%，表明V&A@Ag₂S的毒性相對(duì)較低。V&A@Ag₂S的體內(nèi)毒性也通過(guò)靜脈注射V&A@Ag₂S后24 h和7 d采集血樣進(jìn)行評(píng)估，劑量為2mg×kg^-1。血液生化和血液學(xué)分析顯示，與對(duì)照組相比，指標(biāo)的波動(dòng)可以忽略不計(jì)，表明納米探針具有較高的生物相容性。

圖4。a) 經(jīng)TNF-a處理的HUVECs與V&A@Ag₂S (10 mgmL@1)預(yù)孵卵1 h，然后用或不加SIN-1 (0.5 mm)刺激。b)不同處理HUVECs細(xì)胞質(zhì)內(nèi)NIR-II熒光強(qiáng)度的時(shí)間跨度。比例尺= 10mm

采用了創(chuàng)傷性腦損傷小鼠模型，評(píng)估了所制備的納米探針在體內(nèi)ONOO^-檢測(cè)的可行性。采用對(duì)照顱骨鉆孔穿刺法在胸苷激酶小鼠右側(cè)頭部誘導(dǎo)TBI，以V@Ag₂S (VCAM1偶聯(lián)的Ag2S QDs，“始終on”探針)和V&A@Ag₂S (A1094偶聯(lián)的Ag2S QDs，非靶向探針)作為對(duì)照。靜脈注射永久開(kāi)啟的探針V&A@Ag₂S，開(kāi)始時(shí)熒光信號(hào)在整個(gè)腦區(qū)廣泛分布(圖5)。在捕獲NIR-II熒光圖像的時(shí)間跨度內(nèi)，熒光信號(hào)逐漸衰減，雖然由于極高的背景噪聲導(dǎo)致低信噪比，很難將TBI區(qū)域與正常腦組織區(qū)分開(kāi)來(lái)。可激活的NIR-II探針V&A@Ag₂S允許TBI快速特異的熒光成像。如圖5所示，在注射納米探針后，TBI小鼠右腦半球立即出現(xiàn)了NIR-II熒光信號(hào)，其他區(qū)域均未發(fā)現(xiàn)熒光。由于缺乏背景噪聲，在注射后10分鐘內(nèi)，優(yōu)越的靶組織與正常組織的信號(hào)比(SNR >10.2)實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)快速診斷。隨后，病變部位熒光信號(hào)穩(wěn)定增強(qiáng)，表明V&A@Ag₂S實(shí)現(xiàn)了對(duì)內(nèi)源性RNS的高靈敏度、實(shí)時(shí)原位檢測(cè)。相比之下，在非靶向A@Ag₂S探針組和動(dòng)物對(duì)照組(健康小鼠)的大腦半球均未觀察到顯著信號(hào)。結(jié)果表明，基于這種靶向激活的NIR-II成像策略，ONOO^-動(dòng)態(tài)過(guò)程很容易在活鼠中檢測(cè)到。

圖5。a)注射V@Ag₂S、V&A@Ag₂S、A@Ag₂S后不同時(shí)間點(diǎn)NIR-II熒光在腦血管損傷和健康小鼠中的時(shí)間跨度。b)不同處理后小鼠NIR-II熒光成像測(cè)定的時(shí)間依賴(lài)性信噪比(SNR)變化。

結(jié)論

作者開(kāi)發(fā)了一種可激活的靶向NIR-II熒光納米探針，用于快速、靈敏地檢測(cè)ONOO^-。A1094, ONOO^—響應(yīng)染料的吸光度NIR-II地區(qū)，成功引入NIR-II表面量子點(diǎn)Ag₂S，實(shí)現(xiàn)較低的檢出限。利用NIR-II Ag₂S量子點(diǎn)的獨(dú)特光學(xué)特性，證明了這種納米探針用于TBI模型體內(nèi)RNS檢測(cè)的可行性。該NIR-II生物傳感系統(tǒng)的成功開(kāi)發(fā)標(biāo)志著在體內(nèi)熒光診斷方面邁出了重要的一步。我們?cè)O(shè)想，在體內(nèi)轉(zhuǎn)換傳感和成像策略在第二近紅外窗口將打開(kāi)巨大的潛力熒光成像的臨床實(shí)踐。

參考文獻(xiàn)

Chunyan Li，* Wanfei Li+, Huanhuan Liu, Yejun Zhang, Guangcun Chen, Zijing Li,* Qiangbin Wang*， An Activatable NIR-II Nanoprobe for In Vivo Early Real-Time Diagnosis of Traumatic Brain Injury， Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 247 –252. DOI：10.1002/anie.201911803.

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.201911803

產(chǎn)品提供

靶向NIR-II熒光納米探針