本文成功合成一種新型小分子熒光探針FD-1080，該探針引入磺基和環(huán)己烯基團以提高其水溶性和穩(wěn)定性，在NIR-II區(qū)同時具有激發(fā)和發(fā)射功能，可用于體內(nèi)成像。FD-1080的量子產(chǎn)率為0.31%，與胎牛血清（FBS）結(jié)合后可提高至5.94%。與之前報道的650 nm至980 nm的NIR激發(fā)相比，1064 nm NIR-II激發(fā)具有更高的組織穿透深度和卓越的成像分辨率。FD-1080不僅能夠?qū)崿F(xiàn)無創(chuàng)高分辨率深部組織后肢血管和腦血管生物成像，還能夠用于肝臟呼吸頭尾運動動態(tài)成像對清醒和麻醉小鼠的呼吸頻率進行量化。

確定疾病的正確預后和治療選擇需要準確的生物醫(yī)學成像方法。其中，斷層成像技術(shù)因其穿透深度不受限制的優(yōu)勢而發(fā)揮著重要作用。然而，它們?nèi)匀豢臻g分辨率有限和無法可視化實時動態(tài)?；诠庵掳l(fā)光的生物醫(yī)學成像具有反饋快、靈敏度高和分辨率高的優(yōu)點，但受到組織穿透深度低的限制。二近紅外窗口（NIR-II，1000-1700 nm)由于與可見光(400-700 nm)和傳統(tǒng)的第一近紅外(NIR-I，700-900 nm)相比，在生物組織中具有更深的穿透力（~5-20 mm）而備受關(guān)注。到目前為止，無機NIR-II造影劑包括量子點(QDs)、單壁碳納米管(SWNTs)和稀土摻雜下轉(zhuǎn)換納米粒子(DCNPs)已被建立用于體內(nèi)成像。由于未知的長期毒性問題，開發(fā)有機小分子NIR-II染料以促進FDA批準和臨床轉(zhuǎn)化是可取的。有機近紅外染料亞甲基藍（MB）和吲哚菁綠（ICG）都可以快速排出體外，但是體內(nèi)成像穿透深度有限。到目前為止，只有少數(shù)有機分子在NIR-II區(qū)域產(chǎn)生熒光發(fā)射，所有這些都是高度疏水的、不溶于水的花青或噻嘧啶染料,它必須封裝在聚合物基質(zhì)中進行生物成像，增加的粒徑超過腎臟過濾閾值(~40kD)。最近報道了一種高水溶性小分子CH1055的NIR-II有機染料在在808 nm激發(fā)下，在~1055 nm處發(fā)射。雖然這種小分子染料在臨床前顯示出良好的前景，但對制備工藝簡單、量子產(chǎn)率高和高分辨率成像質(zhì)量的NIR-II有機染料的研究是仍處于起步階段。幾乎所有先前報道的NIR-II發(fā)射染料都在NIR-I區(qū)域(650 nm~900 nm)中被激發(fā)。

組織穿透深度一般取決于激發(fā)光和發(fā)射光的吸收和散射。根據(jù)提出的理論模型：δ=[3μa(μa+μs’)]-1/2,，其中μa是光吸收消光系數(shù)這取決于波長，μs'(~λ-w)是減少的散射系數(shù)，δ是由此產(chǎn)生的穿透深度。指數(shù)(w)取決于組織中散射體的大小和濃度以及范圍從0.22到1.68對于不同的組織。根據(jù)這個模型，可以推測組織穿透深度和成像分辨率將通過激發(fā)波長從NIR-I到NIR-II的紅移而提高，因為散射減少系數(shù)μs'對產(chǎn)生的穿透深度δ的作用比吸收消光系數(shù)μa重要得多。因此，開發(fā)一種具有優(yōu)化NIR-II激發(fā)的新型NIR-II染料對于有效的生物成像至關(guān)重要。我們報道了一種新型小分子有機染料FD-1080的合理設(shè)計，具有最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為1064 nm和1080 nm。FD-1080表現(xiàn)出高水溶性和0.76 kDa的小分子質(zhì)量，完全在腎臟排泄的約40 kDa的大小限制內(nèi)。與臨床批準的NIR-IICG染料相比，F(xiàn)D-1080在連續(xù)激光照射下顯示出優(yōu)異的光穩(wěn)定性。FD-1080的量子產(chǎn)率為0.31%，與胎牛血清（FBS）結(jié)合后可提高至5.94%。與650 nm至980 nm的NIR激發(fā)相比，1064 nm NIR-II激發(fā)具有更高的組織穿透深度和卓越的成像分辨率。實現(xiàn)了左后肢脈管系統(tǒng)、腹部和腦血管的深層組織和高分辨率體內(nèi)成像，允許穿透完整的皮膚、組織和顱骨。我們在1064 nm NIR-II激發(fā)下對FD-1080進行了視頻速率（每秒7.16幀）NIR-II光學動態(tài)成像，以量化小鼠的呼吸頻率。兩個磺酸基團被引入吲哚環(huán)以獲得更高的水溶性。同時，由于共軛次甲基鏈被環(huán)己烯硬化，保證了高穩(wěn)定性。FD-1080在PBS(pH7.0)溶液中的吸收光譜在1046和810 nm處顯示兩個峰。FD-1080在1064 nm激發(fā)下的熒光發(fā)射光譜在1080 nm附近顯示出強烈的NIR-II發(fā)射峰。FD-1080的量子產(chǎn)率確定為0.31%乙醇溶液。FD-1080的熒光在血清蛋白存在的情況下變得非常明亮。將FBS添加到FD-1080中，在40℃下具有不同的孵育時間，導致810 nm處的吸收減少，同時在1046 nm處增加。孵育超過110分鐘后，F(xiàn)D-1080-FBS復合物可以通過FD-1080在位于FBS蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水結(jié)構(gòu)域的親和相互作用達到平衡。在1064 nm激發(fā)下觀察到明亮的熒光，量子產(chǎn)率約為5.94%?；謴偷绞覝睾?，與未加熱的溶液相比，熱穩(wěn)定的染料-蛋白質(zhì)復合物保持了更高的亮度。有機染料之間的相互作用由大，疏水性π系統(tǒng)和血漿蛋白是發(fā)出明亮熒光染料的途徑，主要是由于聚集體受到蛋白質(zhì)結(jié)合的阻礙，并且可以保持剛性染料構(gòu)象以最小化扭轉(zhuǎn)并因此最小化非輻射衰減。隨著熱量的增加，略微加熱處理放大這些效果增加的熱能量允許訪問通常難以接近的疏水性結(jié)構(gòu)域。

添加陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）代替FBS后，F(xiàn)D1080的1064 nm吸收和1080 nm發(fā)射逐漸增加，進一步表明花青染料可以進入膠束的疏水口袋，導致單體比和分子剛性增加添加陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）代替FBS后，F(xiàn)D1080~1064 nm吸收和1080 nm發(fā)射逐漸增加，進一步表明花青染料可以進入膠束的疏水口袋，導致單體比和分子剛性增加。在研究FD-1080染料的成像性能之前，我們首先研究了655~1064 nm不同激發(fā)波長對體模（水中1%Intralipid以模擬生物軟組織）和生物體的散射和穿透效應(yīng)。使用帶有InGaAs相機的自制儀器的硬組織（裸鼠頭骨））。隨著激發(fā)波長從655 nm增加到1064 nm，觀察到更深的穿透深度和更好的體模和硬組織分辨率，表明激發(fā)波長是光學成像的重要因素。通過考慮測量的散射系數(shù)，觀察到的體模成像的波長依賴性合理化對1%Intralipid和裸鼠頭骨的波長。曲線顯示光子散射與波長成反比，這與我們的結(jié)果一致。由于FD-1080從600到1100 nm的吸收光譜很寬，我們可以進一步評估NIR-II激發(fā)與從650到980 nm的傳統(tǒng)NIR激發(fā)相比用于光學成像的性能。為了能夠在不同激發(fā)波長之間進行并排比較，F(xiàn)D-1080在不同波長下的不同吸收強度在檢測前通過InGaAs相機圖像軟件校準到相同。當填充有FD-1080溶液的毛細管以增加的體模深度浸入Intralipid溶液中時，隨著激發(fā)波長從655 nm增加到1064 nm，光子的散射減弱，這解決了銳邊即使浸入深度為5毫米。隨著穿透深度的增加，半峰全寬（FWHM）在被1064 nm激發(fā)時顯示出更好的成像精度。

為了研究激發(fā)波長對體內(nèi)光學成像性能的影響，在靜脈注射FD-1080-FBS復合溶液后，對小鼠左后肢血管和腹部血管進行生物成像，激發(fā)波長從655 nm到1064 nm。由于組織的光吸收、散射和自發(fā)熒光較少，1064 nm NIR-II激發(fā)下的左后肢血管成像性能優(yōu)于具有較短激發(fā)波長的成像性能。不同激發(fā)波長（Iex/I808）的發(fā)射強度比從1.23（I860/I808）增加到22.83（I1064/I808）。同時，我們評估了成像后肢血管的信號背景比(SBR)。與其他較短波長激發(fā)（1.9至2.2）相比，1064 nm激發(fā)獲得了更高的SBR（4.32））。并且通過1064 nm NIR-II激發(fā)的光學成像解析的血管顯示FWHM為0.47mm。此外，包括下腹壁在內(nèi)的整個腹部血管可以在1064 nm激發(fā)下以高分辨率清晰成像。

我們進一步研究了FD-1080與NIR-II激發(fā)對健康小鼠的非侵入性體內(nèi)腦血管成像的成像性能。小鼠頭部通過頭皮和顱骨（顱骨）成像，無需開顱。與通過較短波長(<980 nm)激發(fā)成像的模糊脈管系統(tǒng)相比，通過1064 nmNIR-II激發(fā)發(fā)現(xiàn)了最清晰和最高分辨率的腦血管圖像。通過測量特征橫截面強度分布的FWHM，我們發(fā)現(xiàn)使用808 nm激發(fā)和1064 nm成像的同一上矢狀竇血管的表觀寬度分別為1.43mm和0.65mm，分別表明在較長波長的激發(fā)窗口。

由1064 nm NIR-II激發(fā)光學成像在小鼠頭部解析的最小血管顯示寬度(FWHM)為0.34 mm。裸鼠腦血管的激發(fā)波長依賴性成像可以通過頭皮皮膚和顱骨的消光光譜來解釋，兩者都具有通過激發(fā)波長從NIR-I到NIR-II的紅移而導致光子散射分布下降的特征。我們探索了FD-1080在1064 nm NIR-II激發(fā)下的體內(nèi)深部組織動態(tài)生物成像。將FD-1080靜脈注射到清醒和麻醉的小鼠體內(nèi)后，我們進行了視頻速率（每秒7.16幀）NIR-II光學成像。我們可以根據(jù)肝臟的呼吸頭尾運動來量化呼吸頻率。檢測到清醒小鼠的呼吸頻率為124次呼吸-1，麻醉小鼠的呼吸頻率為71次呼吸-1。雖然無接觸無創(chuàng)之前已經(jīng)報道了NIR-IIQD的深部組織動態(tài)生物成像，這是第一次使用有機染料FD1080實現(xiàn)對清醒和不受干擾的小鼠的非接觸非侵入性生理成像，具有類似的功能。臨床批準的ICG結(jié)構(gòu)，這將促進FDA的批準和臨床轉(zhuǎn)化。


本文開發(fā)了一種有機小分子染料FD-1080，具有1064 nm NIR-II激發(fā)特性、優(yōu)異的水溶性、高量子產(chǎn)率和高穩(wěn)定性。與較短波長(<980 nm)激發(fā)相比，由于減少了組織散射，NIR-II激發(fā)可以實現(xiàn)更深的穿透深度和更高分辨率的體內(nèi)成像性能。


An Efficient 1064 nm NIR-II Excitation Fluorescent Molecular Dye for Deep-Tissue High-Resolution Dynamic Bioimaging，Benhao Li,Lingfei Lu,Mengyao Zhao,Zuhai Lei,Prof. Fan Zhang,Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 7219–7223. DOI：10.1002/anie.201801226https://doi.org/10.1002/anie.201801226