DiO是一種親脂性的熒光染料，可以用來染細胞膜和其它脂溶性生物結(jié)構(gòu)進入細胞膜后，DiO在整個細胞膜上擴散，最佳濃度時可以使整個細胞膜染色。DiO在進入細胞膜之前熒光非常弱，當與細胞膜結(jié)合后其熒光強度大大增強，DiO被激發(fā)后可以發(fā)出綠色的熒光，具有很高的淬滅常數(shù)和激發(fā)態(tài)壽命?？梢杂脴藴实?FITC濾光片檢測。

DiO通常不會明顯影響細胞的生存力(viability)，因此被廣泛用于正向或逆向的，活的或固定的神經(jīng)等細胞或組織的示蹤劑或長期示蹤劑(long-term tracer)。除了最簡單的細胞膜熒光標記外，還可以用于檢測細胞的融合和粘附，檢測發(fā)育或移植過程中細胞遷移，通過FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching)檢測脂在細胞膜上的擴散，標記脂蛋白等。下面和瑞禧生物小編一起來看看一種細胞膜綠色熒光探針的操作步驟：

染色液制備：

配置DMSO或EtOH 儲存液：儲存液用 DMSO或EtOH配置濃度1～5 mM。

注意：未使用的儲存液保存在-20℃，分裝保存，避免反復凍融。

工作液制備：用合適的緩沖液（如：無血清培養(yǎng)基，HBSS或PBS）稀釋儲存液，配制濃度為1～5 μM的工作液。

注意：工作液最終濃度是根據(jù)不同細胞和實驗的經(jīng)驗來配制?？蓮耐扑]濃度的十倍以上找最佳條件。

懸浮細胞染色：

懸浮細胞密度為 1 × 106/mL加入到工作液中。

在37 ℃培養(yǎng)細胞 2～20分鐘，不同的細胞最佳培養(yǎng)時間不同。

染色細胞試管在1000～1500轉(zhuǎn)離心5分鐘。

傾倒上清液，再次緩慢加入預溫37℃的培養(yǎng)液。

粘壁細胞的染色：

使粘壁的細胞在無菌實驗室培養(yǎng)。

從培養(yǎng)基中移走蓋玻片，吸走過量培養(yǎng)液，將蓋玻片放在潮濕的環(huán)境中。

在蓋玻片的一角加入100μL的染料工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞。

在37 ℃培養(yǎng)細胞 2～20分鐘，不同的細胞最佳培養(yǎng)時間不同。

吸干染料工作液，用培養(yǎng)液洗蓋玻片2～3次，每次用預溫的培養(yǎng)基覆蓋所有細胞，培養(yǎng)5～10分鐘，然后吸干培養(yǎng)基。

顯微鏡檢測：

DiD，DiO，DiI，DiR和DiS濾光器的選擇。

多色染料的同時檢測，濾光器按照以下設(shè)定： 

a) DiI和DiO＝Omega XF52，Chroma 51004；

b) DiI和DiD＝Omega XF92，Chroma 51007；

c) DiI，DiO和DiD＝Omega XF93，Chroma 61005

流式細胞儀檢測：

染色的細胞可以分別用經(jīng)典的FL1，FL2，FL3和FL4流式細胞儀檢測。