內(nèi)容提要

通過(guò)將NO結(jié)合的Fe?S團(tuán)簇?fù)饺?/span>脫鐵蛋白腔體，構(gòu)建了具有高負(fù)載效率的光活性NO釋放系統(tǒng)。該系統(tǒng)保持了完整的核-殼結(jié)構(gòu)，顯示具有強(qiáng)的穩(wěn)定性、降低細(xì)胞毒性、高效的細(xì)胞攝取和光控NO釋放等優(yōu)點(diǎn)。

前言

NO作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的氣體信號(hào)分子，已被證實(shí)參與神經(jīng)傳遞、心血管活動(dòng)和免疫系統(tǒng)。NO在疾病過(guò)程中的積極和消極作用，如**生長(zhǎng)或抑制，與NO的產(chǎn)生水平和細(xì)胞敏感性密切相關(guān)。通過(guò)外源性NO作為治療藥物遞送到活的惡性細(xì)胞，可以干擾NO介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或**進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的病理途徑。但是，外源NO的治療效果受其半衰期短和對(duì)生物物質(zhì)的易變性的限制，這個(gè)問(wèn)題傳統(tǒng)是通過(guò)NO供體來(lái)解決，如壬酸鹽和s-亞硝基硫醇衍生物，這些供體在生理?xiàng)l件下不穩(wěn)定，釋放氣態(tài)NO。為了滿足空間和時(shí)間控制NO釋放的關(guān)鍵要求，光活性NO供體可以利用光作為受控激活的觸發(fā)器。天然脫鐵蛋白因其可逆重組特性和對(duì)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的**細(xì)胞的特異性結(jié)合親和力而獨(dú)特，直徑約為8 nm的大空腔允許客體分子大量聚集，已經(jīng)成為藥物傳遞、細(xì)胞成像、納米反應(yīng)器的理想平臺(tái)。本論文將脫鐵蛋白與路森黑鹽(RBS)耦合，構(gòu)建一個(gè)多重NO結(jié)合的鐵-硫簇/蛋白質(zhì)復(fù)合物，在不需要內(nèi)表面工程的情況下提高負(fù)載能力，光控NO釋放，高NO供應(yīng)水平，Fe-NO解離后細(xì)胞毒性鐵離子的保留，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)化。

圖1. (a)脫鐵蛋白及其RBS和RRS化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖；(b) RBS嵌入和光誘導(dǎo)NO釋放的說(shuō)明；(c)RBS/蛋白復(fù)合材料胞內(nèi)內(nèi)化和光誘導(dǎo)胞內(nèi)NO釋放的示意圖。

在pH恒定為7.4的10%乙腈/PBS緩沖液中，以鐵原子與蛋白質(zhì)的摩爾比為500:1，將RBS負(fù)載到脫鐵蛋白中。用10%乙腈/PBS透析，再用PD-10柱純化，得到一個(gè)棕色的RBS-蛋白復(fù)合物(RBS-NP)溶液。通過(guò)KMnO₄氧化法和電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-OES)分析，估計(jì)每個(gè)蛋白質(zhì)的Fe負(fù)載量分別為213和201個(gè)原子。以醋酸鈾酰為陰性染色劑，通過(guò)HR-TEM證實(shí)了RBS-NP完整的結(jié)構(gòu)，與脫鐵蛋白相似，顯示透明的外殼和致密的核被醋酸鈾酰染色(圖2a)。非染色的HR-TEM，RBS-NPs可見(jiàn)為與蛋白腔大小相當(dāng)?shù)陌唿c(diǎn)(圖2a)。在籠內(nèi)大量積累了RBS，可能是由于Fe - S簇與組氨酸、精氨酸和色氨酸等氨基酸殘基的相互作用以及籠內(nèi)疏水環(huán)境。RBS-NPs的平均水合直徑略大于脫鐵蛋白(12.9±2.6 nm vs 10.0±0.9 nm)。如圖2c所示，圓二色(CD)光譜中193 nm處的正峰和208、222 nm處的負(fù)峰均為常數(shù)（圖2c），說(shuō)明RBS摻入過(guò)程確保了蛋白殼的α-螺旋和β片保持在原始狀態(tài)。

圖2. (a) 醋酸鈾酰染色的脫鐵蛋白和RBS-NP，以及未染色的RBS-NP的HR-TEM圖像(標(biāo)尺為50 nm，內(nèi)徑為10 nm)；(b)脫鐵蛋白、RBS-NP和光處理RBS-NP的DLS分析；(c)脫鐵蛋白、RBS-NP和光處理RBS-NP的CD光譜。

白光LED照射(12 mW/cm², 60 min)使NO完全釋放后，RBS在320 ~ 500 nm范圍內(nèi)的吸收帶在PBS (pH 7.4)中消失。光照射引起了RBS-NP的吸收光譜相同的變化，這表明Fe?NO鍵被摻入過(guò)程打斷，并保持了光活性(圖3a)。RBS和RBS-NP的NO積累呈線性時(shí)間依賴性，其穩(wěn)定速率分別為4.6 μM/min和3.3 μM/min(圖3b)。由于RBS在水介質(zhì)中的穩(wěn)定性有限，即使小心地保護(hù)不受光，在RBS溶液中也很容易檢測(cè)到NO。在RBS-NP溶液中，初始NO水平明顯降低，表明RBS在疏水環(huán)境中籠化提高了RBS的穩(wěn)定性。因此，RBS-NP可作為一種光控釋放NO的平臺(tái)而不會(huì)對(duì)籠狀結(jié)構(gòu)造成損傷。

圖3. (a) RBS-NP在光照前后的吸收光譜;(b)由RBS和RBS- np產(chǎn)生的NO濃度隨光照時(shí)間的變化曲線。

因?yàn)?/span>Fe - S團(tuán)簇被籠化而不是被脫鐵蛋白外殼吸收，所以脫鐵蛋白材料的細(xì)胞內(nèi)化不會(huì)受到Fe - S團(tuán)簇的影響。作者對(duì)兩種**細(xì)胞系HeLa和MCF-7進(jìn)行了體外光活性和毒性實(shí)驗(yàn)。RBS-NP 16 h的細(xì)胞培養(yǎng)，用PBS洗滌，DCF-FM DA染色，白光LED曝光(12 mW /cm²) 30分鐘。在熒光顯微鏡下，RBS-NP處理的HeLa細(xì)胞的亮綠色圖像反映了有效的細(xì)胞攝取和光誘導(dǎo)的NO釋放(圖4a)。經(jīng)過(guò)RBS或RBS-NP處理的MCF-7細(xì)胞和光處理后，其熒光強(qiáng)度明顯降低，可能是由于細(xì)胞內(nèi)清除反應(yīng)的存在縮短了NO壽命。為了研究細(xì)胞反應(yīng)是否與細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平有關(guān)，我們使用熒光反應(yīng)氧物種(ROS)探針DCFH-DA對(duì)H₂O₂處理的HeLa和MCF7細(xì)胞進(jìn)行了成像，無(wú)論光照與否。光暴露不影響ROS水平。與HeLa細(xì)胞不同，MCF-7細(xì)胞在H₂O₂的作用下表現(xiàn)出ROS水平的抑制，而HeLa細(xì)胞則表現(xiàn)出細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高。因此，氧化應(yīng)激反應(yīng)似乎存在細(xì)胞類型依賴機(jī)制。

MTT法測(cè)定了RBS和RBS-NP在黑暗條件下的細(xì)胞毒性。在0.5、1、2、3、4、6、8和10 μg/mL鐵濃度下，分別用RBS或RBS-NP處理HeLa和MCF細(xì)胞48 h，然后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。在HeLa細(xì)胞中，RBS和RBS-NP的IC₅₀值分別為3.7和5.4 μg/mL Fe(圖4b)。在MCF-7細(xì)胞中，也觀察到相對(duì)于RBS，暗色RBS-NP的細(xì)胞毒性降低。對(duì)于正常細(xì)胞，RBS和RBS-NP在人肝細(xì)胞QSG細(xì)胞上表現(xiàn)出類似的鐵濃度依賴性的存活率，IC₅₀值增加到約10 μg/mL。此外，研究了NO釋放對(duì)HeLa和MCF-7細(xì)胞的光毒性作用。細(xì)胞治療與RBS或RBS-NP鐵劑量為1.0μg/mL 16 h，然后被白光LED曝光(12 mW/cm²)不同分鐘(0、5、10、15、20、25、30分鐘)，與PBS再孵育24小時(shí)。如圖4c所示，用脫鐵蛋白處理HeLa細(xì)胞，或光處理，或暗處理RBS，或暗處理RBS-NP均不影響細(xì)胞活力。RBS或RBS-NP處理過(guò)的MCF-7細(xì)胞表現(xiàn)出更高的光照耐受性，這是由于上述MCF-7細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的抑制。細(xì)胞以不同的途徑吸收RBS和RBS-NP。小尺寸疏水的RBS具有細(xì)胞膜通透性，而RBS-NP只能通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用內(nèi)化，導(dǎo)致鐵攝取速率的差異。HeLa和MCF細(xì)胞治療由RBS和在同一初始RBS-NP鐵濃度(3μg/mL)在無(wú)血清培養(yǎng)基遠(yuǎn)離光1或2 h。對(duì)于HeLa細(xì)胞，在孵育后1 h和2 h, RBS-NP處理導(dǎo)致鐵的攝入量分別比RBS多14和5.3%；對(duì)于MCF-7細(xì)胞，在1和2小時(shí)內(nèi)，RBS-NP處理比RBS分別增加了18和12%的鐵攝入量。因此，RBS的吸收可以通過(guò)籠狀策略增強(qiáng)。

圖4。(a)使用DCF-FM DA作為NO探針，在光照前和光照后使用RBS或RBS-NP處理的HeLa細(xì)胞的熒光圖像；(b)不同Fe濃度下RBS和RBS- np處理HeLa細(xì)胞的MTT分析；(c)不同照射時(shí)間下，脫鐵蛋白或RBS或RBS- np處理的HeLa細(xì)胞的MTT分析。

結(jié)論

作者在pH 7.4下將光活性Fe-S團(tuán)簇加入脫鐵蛋白的籠子內(nèi)部，避免了傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分解重組過(guò)程。體積龐大的RBS復(fù)合物以42%的負(fù)載效率封裝。疏水蛋白籠對(duì)水敏感的RBS具有顯著的穩(wěn)定性，納米級(jí)復(fù)合材料可保存在PBS緩沖液中，且至少有2個(gè)月的保質(zhì)期。RBS復(fù)合材料的高效細(xì)胞攝取和光控NO釋放特性允許細(xì)胞類型依賴性的藥物應(yīng)用于基于NO的治療。

參考文獻(xiàn)

Xiao Li, Yajie Zhang, Jian Sun, Weijian Chen, Xuewei Wang, Fenli Shao, Yuyu Zhu, Fude Feng* , Yang Sun*，Protein Nanocage-Based Photo-Controlled Nitric Oxide Releasing Platform, ACS Appl. Mater. Interfaces, 2017, 9, 19519?19524. DOI: 10.1021/acsami.7b03962. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.7b03962

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