內(nèi)容提要

**的精確治療越來越受到重視。γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)是**中顯著上調(diào)表達(dá)的生物標(biāo)志物。作者開發(fā)了一種GGT響應(yīng)的近紅外(NIR)納米粒子，用于**特異性熒光成像引導(dǎo)的光熱治療。GGT響應(yīng)性近紅外探針NRh-G自發(fā)聚集成納米粒子NRh-G-NPs。該納米粒子經(jīng)與GGT特異反應(yīng)熒光增強(qiáng)約180倍，并表現(xiàn)出良好的光熱效應(yīng)。在激光照射下，NRh-G-NPs可以選擇性地照亮U87MG**細(xì)胞并進(jìn)行消融。在荷瘤小鼠體內(nèi)靜脈注射NRh-G-NPs后，NRh-G-NPs可以到達(dá)**區(qū)域并特異地照亮**，對(duì)U87MG**中過表達(dá)的GGT有特異性反應(yīng)，選擇性地照亮**進(jìn)行成像引導(dǎo)治療。在激光照射后，**可完全清除，40天內(nèi)無**復(fù)發(fā)。

前言

癌癥對(duì)人類健康和生命構(gòu)成重大威脅。除手術(shù)、放療、化療等多種癌癥治療方法外，光熱療法(PTT)近年來因其高療效和特異性而備受關(guān)注。在光熱轉(zhuǎn)換劑的幫助下，光照射被吸收并轉(zhuǎn)化為熱量，以最小的副作用破壞癌組織。理想的光熱轉(zhuǎn)化劑應(yīng)該是無毒的，具有高**靶向性和高效的光熱轉(zhuǎn)化能力。自成像能力是識(shí)別光熱劑積累的首選更好地指導(dǎo)激光手術(shù)窗口和劑量。在各種光熱制劑中，有機(jī)染料因其排泄快、生物相容性好、臨床轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)而備受關(guān)注?；诨ㄝ己投量┑挠袡C(jī)染料在近紅外(NIR)光激發(fā)下具有更高的穿透深度，因此代表了**治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來，智能納米系統(tǒng)的診斷和治療功能可以通過**微環(huán)境(如pH、缺氧、酶)或外部刺激(如光、超聲、磁)在**區(qū)域選擇性激活，具有更高的治療選擇性和效率。本研究通過響應(yīng)GGT的近紅外花菁熒光團(tuán)(NRh-G)在水中自發(fā)聚集成納米粒子NRh-G-NPs，在正常生理環(huán)境下保持OFF狀態(tài)，而在過表達(dá)GGT的**細(xì)胞中NRh-G-NPs上的γ-Glu部分被特異性識(shí)別并被切斷開啟了熒光和光熱能力，從而最大限度地提高了治療的特異性和準(zhǔn)確性。

結(jié)果與討論

NRh-G的結(jié)構(gòu)由GGT特異性底物γ-Glu和近紅外花菁熒光團(tuán)NRh-NH₂組成。氨基酸γ-Glu作為GGT識(shí)別底物被廣泛應(yīng)用，可被GGT特異性識(shí)別和切割。NRh- NH₂在740 nm處具有較強(qiáng)的熒光，隨后與Boc-Glu-OtBu反應(yīng)生成中間產(chǎn)物NRh-G-Boc，通過Boc脫保護(hù)反應(yīng)生成最終產(chǎn)物NRh-G(圖1A)。NRh-G-NPs進(jìn)入GGT高表達(dá)環(huán)境后，γ-Glu部分被特異性識(shí)別并裂解。將NRh-G-NPs轉(zhuǎn)化為NRh-NH₂-NPs，在714 nm處有近紅外吸收峰，在740 nm處有熒光恢復(fù)(圖1B)。TEM圖像顯示單分散的NRh-G-NPs，尺寸約為50 nm(圖1C)。經(jīng)GGT處理后，NRh-NH₂-NPs的大小減小到20-30 nm。DLS測(cè)量的水動(dòng)力學(xué)尺寸從90 nm (圖1D)降至70 nm，Zeta電位也從-0.3 mV(圖1D)改變到6.0 mV。用GGT處理30分鐘，在714 nm處出現(xiàn)紫外吸收峰(圖1E)。隨著孵育時(shí)間(0 ~ 30 min，圖1F)和GGT濃度(0 ~ 1.0 U/L，圖1G)的增加，740 nm處的熒光發(fā)射逐漸增加。

圖1。(A) NRh-G的化學(xué)結(jié)構(gòu)和合成步驟。(B) NRh-G自組裝形成NRh-G-NPs，然后被GGT切割形成NRh-NH₂-NPs發(fā)出熒光。(C)納米粒子的TEM圖像。(D)通過動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測(cè)量的納米顆粒的水合粒徑和zeta電位。(E) NRh-G-NPs (5.8 μg/mL)與GGT (0.4 U/L)反應(yīng)前后溶液的紫外吸收光譜。(F) GGT (0.4 U/L) 0 ~ 30 min, NRh-G-NPs (5.8 μg/mL)的熒光光譜變化。(G)不同濃度的GGT (0 ~ 1.0 U/L)孵育30 min后，NRh-G-NPs(5.8 μG /mL)的熒光光譜變化。(H) NRh-G-NPs (5.8 μg/mL)對(duì)GGT (0.4 U/L)以及其它干擾物種 (0.5 mM)的熒光強(qiáng)度。

NRh-G-NPs在U87MG細(xì)胞中的細(xì)胞毒性表明，不同濃度的NRh-G-NPs在0 ~ 57.6 μg/mL范圍內(nèi)的細(xì)胞存活率均超過90%，表明NRh-G-NPs適合用于活細(xì)胞成像。用NRh-G-NPs檢測(cè)活細(xì)胞中GGT的活性。首先，在NRh- G-NPs作用下，U87MG細(xì)胞的熒光隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，在20分鐘左右達(dá)到穩(wěn)定值(圖2A)。作者用特定的GGT抑制劑(azaserine)對(duì)U87MG細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，然后與NRh-G-NPs (5.8 μg/mL)孵育20分鐘，經(jīng)抑制劑預(yù)處理的細(xì)胞的熒光信號(hào)明顯下降(圖2B)。當(dāng)高酶表達(dá)的U87MG細(xì)胞與NRh-G-NPs孵育20 min時(shí)，觀察到強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。而相同時(shí)間的NRh-G-NPs處理低酶表達(dá)L02細(xì)胞顯示出較弱的熒光。當(dāng)L02細(xì)胞用GGT促進(jìn)劑預(yù)處理，然后與NRh-G-NPs共孵育20分鐘時(shí)，觀察到熒光信號(hào)增強(qiáng)(圖2C)[59]。因此，NRh-G-NPs可以區(qū)分正常細(xì)胞和癌細(xì)胞，而且確實(shí)具有GGT特異性。由于GGT是氧化應(yīng)激的早期敏感標(biāo)記物，作者研究了GGT與潛在的抗癌藥物NaBu協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用。預(yù)處理細(xì)胞中NaBu濃度越高，與NRh-G-NPs孵育后的熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。同時(shí)，高濃度NaBu預(yù)處理后死細(xì)胞比例顯著增加。因此，抗癌藥物NaBu和NRh-G-NPs可以同時(shí)用于癌癥的診斷和治療。

圖2。(A) NRh-G-NPs(5.8μg/mL)孵育0、5、10、15、20分鐘U87MG細(xì)胞的熒光共聚焦圖像。(B) NRh-G-NPs(5.8μg/mL)孵育U87MG細(xì)胞的熒光共聚焦圖像;NRh-G-NPs(5.8μg/mL)孵育GGT抑制劑預(yù)處理的U87MG細(xì)胞的共聚焦熒光圖像。(C) NRh-G-NPs(5.8μg/mL)孵育U87MG細(xì)胞和L02細(xì)胞的共聚焦熒光圖像；NRh-G-NPs (5.8μg/mL)孵育的GGT促進(jìn)劑預(yù)處理(1.0 mM) L02細(xì)胞共聚焦熒光圖像。比例尺:10 μm。

通過尾靜脈將納米顆粒注射到U87MG荷瘤裸鼠體內(nèi)，評(píng)價(jià)NRh-G-NPs對(duì)體內(nèi)**的被動(dòng)靶向能力。采用生物發(fā)光成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)全身熒光。從圖3A可以看出，在注射NRh-G-NPs的小鼠**中，熒光逐漸增加，在1.5 h時(shí)熒光最強(qiáng)，隨后在注射5h后熒光開始減弱并完全消失。定量分析顯示，注射NRh-G-NPs的小鼠的信噪比(SNR)在1.5 h內(nèi)顯著上升，然后開始下降。注射NRh-G-NP 1.5 h后解剖小鼠，切除心臟、脾臟、**、肺、腸、腎、肝進(jìn)行生物成像。與其他器官相比，**的熒光非常強(qiáng)。切片**組織后也進(jìn)行共聚焦成像(圖3C)。對(duì)深度為35 μm的U87MG**組織切片進(jìn)行三維重建。結(jié)果表明，NRh-G-NPs通過被動(dòng)靶向**定位，可用于**中GGT的有效實(shí)時(shí)無創(chuàng)成像。

圖3。(A)通過尾靜脈注射NRh-G-NPs (2.9 mg/mL)后小鼠的實(shí)時(shí)熒光圖像。(B)小鼠尾靜脈注射NRh-G-NPs 1.5 h后，從U87MG荷瘤小鼠中切除的心臟(1)、脾臟(2)、**(3)、肺(4)、腸(5)、腎(6)和肝(7)的熒光圖像。(C) U87MG**組織切片深度在35μm之間的共聚焦z掃描成像切片。標(biāo)尺: 100μm。

當(dāng)GGT特異性切斷NRh-G-NPs的氨基酸鏈時(shí)，產(chǎn)物NRh-NH₂-NPs在730 nm激光照射下表現(xiàn)出光熱效應(yīng)和730 nm激光照射下的光熱效應(yīng)(圖4A)。不同濃度的NRh-G-NPs加入或不加入1.0 U/L酶孵育20 min，然后在730 nm (1.0 W/cm₂)激光照射下孵育5min。激光照射下，未加GGT處理的不同濃度NRh-G-NPs的溫度沒有明顯變化(圖4B)。而在相同激光照射條件下，酶培養(yǎng)后的升溫速度和最終達(dá)到的溫度與NRh-G-NPs的濃度成正比(圖4C)。圖4B和圖4C中的NRh-G-NPs (34.6 μg/mL)在730 nm激光照射5分鐘后的紅外熱像圖如圖4D，同時(shí)也證實(shí)了NRh-NH₂-NPs具有良好的光熱穩(wěn)定性。不同濃度的NRh-NH2在730 nm激光照射5分鐘，通過監(jiān)測(cè)了溫度的變化，NRh-G-NPs與GGT的反應(yīng)產(chǎn)物具有優(yōu)良的光熱性能。

圖4。(A)光熱特性開啟示意圖。(B)不同濃度NRh-G-NPs(0、11.5、25.9、34.6、57.6 μg/mL)在730 nm (1.0 W/cm₂)光照5分鐘后的溫度曲線。(D)無GGT孵育和有GGT孵育的NRh-G-NPs (34.6 μg/mL)的紅外熱像圖。

NRh-G-NPs對(duì)U87MG癌細(xì)胞無明顯的細(xì)胞毒性，即使在高達(dá)57.6 μg/mL的蛋白濃度下也無明顯的細(xì)胞毒性，作者使用730 nm激光照射不同濃度的NRh-G- NPs孵育的細(xì)胞。隨著NRh-G-NPs濃度的增加，細(xì)胞存活率顯著降低(圖5A)。激光照射后NRh-G-NPs孵育細(xì)胞的死亡率較高，GGT抑制劑預(yù)孵育后細(xì)胞死亡率下降(圖5B, 5C)。因此，鈣黃素和碘化丙啶共染色細(xì)胞的MTT檢測(cè)和倒置熒光成像進(jìn)一步證實(shí)了NRh-G-NPs對(duì)U87MG細(xì)胞的有效和特異性光熱消融作用，在特定條件下能體外殺傷**細(xì)胞。

圖5。(A)在730 nm激光(1.0 W/cm²)照射下，不同濃度的NRh-G-NPs誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞的相對(duì)存活率。(B)不同孵育條件下隨730 nm激光(1.0 W/cm²)孵育U87MG細(xì)胞的細(xì)胞毒性。(C) 不同孵育條件下U87MG細(xì)胞，經(jīng)鈣綠素AM/PI染色后，置于730 nm激光(1.0 W/cm²)照射前的倒置熒光圖像。

基于NRh-G-NPs在體內(nèi)對(duì)**的被動(dòng)靶向及其強(qiáng)近紅外吸收，我們?cè)谛∈?/span>U87MG細(xì)胞皮下**模型上進(jìn)行了體內(nèi)光熱治療的研究(圖6A)。采用紅外熱像儀每隔1 min直接監(jiān)測(cè)小鼠體溫。在靜脈注射NRh-G- NPs或生理鹽水1.5 h后，小鼠暴露于730采用紅外熱像儀監(jiān)測(cè)溫度(圖6B)。注射NRh-G-NPs的小鼠，在激光照射下**表面溫度從36°C迅速上升到54°C。在相同的照射條件下，其他各組小鼠的**溫度沒有明顯變化(圖6D)。H&E染色的**切片組織學(xué)檢查顯示，在激光照射后，只有NRh-G-NPs注射組的**結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損(圖6C)。治療組(NRh-G-NPs +激光)小鼠**經(jīng)過2天的光熱治療完全消融，觀察期間未見**再生。注射生理鹽水或NRh-G-NPs，或僅注射相同功率的激光照射對(duì)**生長(zhǎng)沒有影響(圖6E)。治療后1天解剖**的照片顯示， NRh-G-NPs + Laser組**明顯縮小，而其他三組**體積增大。治療14 d后，4組小鼠均處死，切取主要臟器進(jìn)行H&E染色。結(jié)果顯示，器官?zèng)]有受到任何明顯的損傷。四組小鼠的體重也沒有異常變化(圖6F)。與3個(gè)對(duì)照組的平均壽命相比，經(jīng)過NRh-G-NPs誘導(dǎo)的光熱治療的小鼠存活超過40天(圖6G)。NRh-G-NPs可以在動(dòng)物模型中有效、準(zhǔn)確地治療**而不損傷其他器官。

圖6。(A)光熱治療流程圖。(B) U87MG荷瘤小鼠靜脈注射生理鹽水或NRh-G-NPs (2.9 mg/mL)的紅外熱像圖；對(duì)U87MG荷瘤小鼠在730 nm激光(1.0 W/cm₂)照射下靜脈注射生理鹽水或NRh-G-NPs (2.9 mg/mL)的紅外熱像圖。(C) H&E染色治療組和其他三個(gè)對(duì)照組的**切片。(D)根據(jù)(B)中紅外熱像數(shù)據(jù)得出的**溫度變化。(E)不同治療組小鼠的**生長(zhǎng)曲線。(F)各組小鼠體重。(G)不同治療組小鼠的存活率。

結(jié)論

作者合成了一種能特異性檢測(cè)和治療惡性**的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶激活的近紅外納米粒子NRh-G-NPs，在血液循環(huán)過程中不表現(xiàn)出熒光或光熱效果。EPR效應(yīng)導(dǎo)致**高聚集，被**部位高表達(dá)的酶GGT激活，生成的NRh-NH₂-NPs顯示出強(qiáng)大的熒光發(fā)射，可用于**診斷，并在光熱治療中顯示出優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換特性。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均證明了NRh-G-NPs對(duì)**治療的特異性和有效性，在熒光成像引導(dǎo)的光熱治療中具有巨大的潛力。

參考文獻(xiàn)

Fangyuan Zhou, Shikui Yang, Chao Zhao, Wangwang Liu, Xufeng Yao, Hui Yu, Xiaolian Sun*, Yi Liu*, Theranostics, 2021, 11, 7045-7056. DOI: 10.7150/thno.60586. https://www.thno.org/v11p7045.html.

產(chǎn)品提供

近紅外γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)熒光探針