內容提要

本文介紹了一種**微環(huán)境(TME)激活的NIR-II納米**診斷系統(FEAD1)，用于腹腔轉移瘤的精確診斷和治療。FEAD1是通過自組裝肽Fmoc-His，Er³⁺和巰基丙酸功能化的Ag₂S量子點(MPA-Ag₂S QDs)、化學藥物阿霉素(DOX)和近紅外吸收劑A1094成納米粒子制備。在健康組織中，由于Ag₂S QDs-A1094相互作用，FEAD1處于NIR-II熒光“關閉”狀態(tài)，而DOX處于包裹狀態(tài)。FEAD1遞送到**后，酸性TME通過破壞Fmoc-His和DOX疏水相互作用釋放A1094開啟Ag₂S熒光，同時在**組織內爆發(fā)釋放DOX，從而實現精準的**治療。

前言

納米診療系統集成了診斷和治療功能，在早期**檢測、藥代動力學和藥效學監(jiān)測，以及評估治療效果，實現個性化治療方面具有巨大的潛力。**微環(huán)境(TME)在**的發(fā)展和進展中起著特別重要的作用，可以實現納米疾病系統中“關閉”-“打開”開關的精確操作。人們在開發(fā)基于各種成像模式的TME激活治療系統方面投入了大量精力。此類治療系統主要基于單一可激活的功能，而綜合可激活的納米**治療方法，診斷與治療結合還鮮有報道，因此，設計精確的TME激活治療系統，同時協同癌癥診斷和治療仍然是一個最大的挑戰(zhàn)。第二近紅外窗口(NIR-II, 1000-1700 nm)的熒光成像具有更高的穿透深度和時空分辨率。作者提出了一種智能NIR-II納米**治療系統(Fmoc-His/Er³⁺/Ag₂S/DOX/A1094，標記為FEAD1)，該系統基于多成分協調自組裝策略，響應TME，用于腹膜轉移的準確診斷和治療。由于FRET在Ag₂S量子點與A1094之間的猝滅，所制備的FEAD1納米顆粒表現出的NIR-II熒光可忽略不計。在酸性條件下，Fmoc-His和DOX的咪唑基團的質子化會使熒光迅速打開，從而削弱其金屬-配位和疏水相互作用分別導致FEAD1的拆卸和FRET的丟失。作者發(fā)現腹腔注射(IP)后，腹膜轉移的**結節(jié)被特異性點亮實現NIR-II熒光成像。TME介導的藥物爆發(fā)性釋放，達到高水平的積累和滲透到**深層組織，顯著抑制小鼠**生長。

圖1。a) FEAD1在pH 7.4和pH 5.5時的TEM圖像。b)流體力學直徑表征；c) Fmoc-His、Fmoc-His/Er³⁺、Fmoc-His/Er³⁺/MPA-Ag₂S和MPA-Ag₂S的FTIR光譜。d) Ag₂S、FEAD和FEAD1的吸光度和熒光光譜。

FEAD1通過簡單的兩步制備。圖1 a中的透射電子顯微鏡(TEM)圖像說明了FEAD1在不同pH水溶液中的兩種不同的形態(tài)。FEAD1出現作為常規(guī)球狀聚合直徑95 nm在pH值為7.4，與動態(tài)光散射分析結果(圖1 b)。 FEAD1在pH值為5.5時迅速分解。ζ勢分析顯示FEAD1具有正的表面電荷特性。由于A1094的吸收光譜與Ag₂S量子點的發(fā)射光譜存在大量重疊，FEAD1的NIR-II熒光處于“關”狀態(tài)(猝滅效率超過82%)。FEAD1具有較寬的吸收帶，在490 nm處達到峰值，證實了DOX的包封率為55%。

為了證明FEAD1在不同pH條件下對細胞的特異性響應，作者采用寬帶熒光顯微鏡(400-1700 nm)進行顯微熒光成像。研究了人乳腺癌MDAMB-231細胞和正常小鼠成纖維細胞L929細胞FEAD分別在兩種不同pH(7.4和5.5)條件下處理3 h，然后用Hoechst染色。如圖2 a所示，L929細胞在pH 7.4時，細胞質和細胞核的NIR-II Ag₂S QD和DOX熒光信號可以忽略不計，說明FEAD1在生理pH條件下具有良好的穩(wěn)定性。pH 7.4下MDA-MB-231癌細胞的NIR-II Ag₂S QD和DOX熒光信號較弱，這可能與**細胞的內吞消化能力顯著提高有關。在pH值5.5，明亮NIR-II熒光發(fā)生在細胞質中MDAMB-231的癌癥細胞。對MDA-MB-231癌細胞內DOX熒光強度的定量顯示，pH 5.5時FEAD1處理后，信號增強約為pH 7.4時的4倍。以上的細胞攝取結果證實FEAD1經歷了pH激活的分解，觸發(fā)了癌細胞的特異性發(fā)光和藥物向癌細胞的爆發(fā)性釋放。FEAD1孵育的MDAMB-231細胞在pH 5.5時的活力明顯低于pH 7.4時(圖2b)。通過流式細胞術定量分析了上述毒性實驗的結果(圖2c)，表明FEAD1處理MDA-MB-231癌細胞的晚期凋亡率是濃度和pH依賴性的。在pH7.4條件下，L929細胞幾乎沒有檢測到細胞凋亡。

圖2。a) 不同pH條件下FEAD1處理L929細胞和MDAMB-231細胞的顯微熒光圖像。 b) MTT。c) 不同處理后MDA-MB-231細胞和L929細胞的流式細胞儀檢測。

利用表達螢火蟲熒光素酶報告基因(Luc-MDA-MB-231)的MDA-MB-231細胞建立IP**模型，為**定位提供內源性標記物。將可激活的納米**系統FEAD1腹腔注射到荷瘤動物體內，在體內實時進行NIR-II成像，監(jiān)測FEAD1在體內的行為。由于FEAD1是在生理pH條件下猝滅的，因此在小鼠腹腔注射后幾乎沒有檢測到NIR-II熒光信號(圖3a)。熒光信號在注射后5分鐘開始出現，并隨著時間的推移逐漸增加，在注射后2小時達到最大值。NIR-II熒光信號與我們觀察到生物發(fā)光信號，提示FEAD1能夠高度特異地敏感性照亮腹膜轉移**結節(jié)(圖3c,d)。隨后，NIR-II熒光信號在較長時間內保持穩(wěn)定。在NIR-II熒光的引導下，轉移性結節(jié)可以清晰地輪廓和切除。標準的H&E染色證實切除的結節(jié)包含**組織(圖3e)。FEAD1引導下切除的**熒光共定位圖像顯示，核密度顯著增加的**組織從NIR-II Ag₂S QD和DOX產生強烈的熒光信號，而從健康組織發(fā)出的熒光可以忽略(圖3f)。結果表明FEAD1可以精確定位于**組織，確保給藥是針對腹膜轉移的。

圖3。a) 同一小鼠腹腔注射FEAD1后NIR-II熒光圖像的時間過程。b)**-背景比作為NIR-II圖像時間的函數。c) FEAD1腹腔注射腹膜轉移模型術前分期的NIR-II和生物發(fā)光圖像。d)切除**結節(jié)的NIR-II熒光和生物發(fā)光圖像。e)**切片H&E染色。比例尺:100 mm。f) 從切除的**結節(jié)中獲得的**切片熒光圖像。比例尺:100 mm

將LucMDA-MB-231細胞移植到裸鼠腹膜轉移模型中，評估FEAD1的體內抗**療效。在體外實驗結果和藥物釋放動力學的指導下，將FEAD1給予小鼠，每周3次，連續(xù)2周，PBS組、游離DOX組和FEA1組作為對照組，在一系列時間點用生物發(fā)光成像(BLI)監(jiān)測腹部**的生長情況(圖4a)。通過生物熒光信號獲得的定量數據表明，與PBS、游離DOX和FEA1相比，FEAD1對**生長具有更強的抑制作用(圖4 b)。因此，FEAD1組(3.5 mg kg?1阿霉素)顯著改善(圖4 c)。PBS組和FEA1組小鼠體像顯示**負荷增加導致腹膜后大量積水，表現為腹部增大。另外，將不同處理后荷瘤小鼠的**組織切片，采用原位末端脫氧核苷酸轉移酶(dUTP)末端標記法(TUNEL)分析。如圖4 d所示，FEAD1處理的**比游離DOX、FEA1或PBS處理的**具有更顯著的凋亡信號，與體外細胞毒性數據相一致，這種可激活策略大大提高了FEAD1的**致死能力。為探討FEAD1增強腹腔轉移瘤的抗**作用機制，采用熒光顯微鏡觀察MDA-MB-231**內藥物的分布。注射后48 h，**組織中均觀察到較強的NIR-II和DOX熒光發(fā)射，在整個組織中分布均勻。表明FEAD1在到達TME后得到了有效的分解，進而實現了對**深部組織的高效滲透。FEA1組**邊緣NIR-II熒光信號非常微弱。由于其代謝速度快，游離DOX組在**部位顯示微弱的熒光信號，證實了FEAD1在健康組織中處于隱身模式，而在**部位進行爆發(fā)性釋放，從而提高了治療效率。

圖4。a) 腹腔移植luca - mda - mb231癌細胞的裸鼠分別經過不同藥物治療1周和3周后的生物發(fā)光圖像。b)不同處理2周后小鼠生物發(fā)光定量測定。c) 不同藥物配方的存活率。d) PBS、DOX、FEA1、FEAD1處理荷瘤小鼠**切片后進行TUNEL染色。比例尺:100 mM。

結論

作者構建了一個可激活的多組分協調自組裝納米**系統，用于腹膜轉移的精確診斷和治療。FEAD1作為酸響應的咪唑基團和DOX，在酸性TME條件下可快速降解。在酸性TME條件下保持隱身模式健康的組織，產生超靈敏的檢測和有效的治療與最小的副作用。這種可激活的納米系統還具有膠體穩(wěn)定性和光學穩(wěn)定性合理、載藥效率高、生物相容性好等顯著優(yōu)點。這些優(yōu)點使這種新型的可激活NIR-II納米**系統具有很大的臨床應用潛力。

參考文獻

Tumor Microenvironment-Activated NIR-II Nanotheranostic System for Precise Diagnosis and Treatment of Peritoneal Metastasis，Sisi Ling, Xiaohu Yang, Chunyan Li,* Yejun Zhang, Hongchao Yang, Guangcun Chen, Qiangbin Wang*， Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 7219–7223. DOI：/10.1002/anie.202000947.

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202000947

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