蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾（NH2-PEG-MAL NHS-PEG-SH）

蛋白質(zhì)的PEG修飾主要包括：蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈基團(tuán)的改變和蛋白質(zhì)分子中主鏈結(jié)構(gòu)的改變二個(gè)方向。關(guān)于側(cè)鏈基團(tuán)修飾的研究較多。化學(xué)修飾反應(yīng)的活性和選擇性主要由蛋白質(zhì)功能基的反應(yīng)活性及修飾劑的反應(yīng)活性決定[5]。其中蛋白質(zhì)功能基的活性由微區(qū)極性和空阻效應(yīng)決定。修飾劑的反應(yīng)活性主要取決于修飾劑分子中官能團(tuán)的類型。

我們可以用于蛋白修飾的PEG有化學(xué)法修飾方法，目前常用的有三種基團(tuán)修飾，PEG修飾的基團(tuán)主要是氨基如（MAL-PEG-NH2）、巰基如（HS-PEG-COOH）、羧基如（COOH-PEG-OH）等。下面我們主要介紹這三種修飾方法：

方法1：氨基法修飾蛋白(NH2-PEG)

可能用的到的產(chǎn)品：

NH2-PEG-COOH

NH2-PEG-MAL

NH2-PEG-N3

NH2-PEG-Alkyne

NH2-PEG-SH

NH2-PEG-Biotin

NH2-PEG-OPSS

NH2-PEG-OH

蛋白質(zhì)分子表面的游離氨基(主要為Lys殘基側(cè)鏈的氨基)具有較高的親核反應(yīng)活性。因此Lys殘基的氨基成為最方便,最常用的被修飾基團(tuán)。PEG的分子量大多為5kD。目前最常用的活化劑有氰尿酰氯(亦稱三聚氯氰)(見(jiàn)圖1)和N-羥基琥珀酰亞胺(見(jiàn)圖2)。

(1)氰尿酰氯法特點(diǎn)是試劑易得、活化簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短、方便經(jīng)濟(jì)。但其對(duì)有些酶(例如:SOD)的活性有影響。這種活化中間物有兩種形式:一種是一分子氰尿酰氯與一分子PEG偶聯(lián)(PEG1);另一種是一分子氰尿酞氯與兩分子PEG偶聯(lián)(PEG2)。通常PEG2修飾的蛋白質(zhì)效果要更好。它可以在較低的修飾程度下獲得解除免疫原性產(chǎn)物,而且生物活性保留明顯高于PEG1修飾的產(chǎn)物。(2)在pH=7～ 9條件下,PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯類化合物可以直接修飾殘基上的氨基。將PEG上的羥基轉(zhuǎn)化為羧基,其中最常用的是通過(guò)羥基與琥珀酸酐反應(yīng),

所得衍生物化合物為PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯[6]。此外,N-末端氨基修飾也是一種常用的修飾方法。蛋白質(zhì)N端氨基的pKa(7.6～8.0),小于蛋白質(zhì)其他部位的氨基(如賴氨酸的pKa為10.0～10.2)。因此,在較低pH值(如pH 5.0)溶液中,PEG-醛主要與N-端氨基反應(yīng)生產(chǎn)希夫堿,后被還原為仲胺。

方法2：巰基修飾（PEG-SH/Thiol）

可能用的到的產(chǎn)品：

HS-PEG-NHS

Biotin-PEG-SH

CHO-PEG-SH

Hydrazide-PEG-SH

Silane-peg-SH

Acrylates-peg-SH

Lipoicacid-peg-SH

Tosylate-peg-SH

蛋白質(zhì)上的修飾基團(tuán)多為親核性的,其活性的順序是:巰基>α -氨基>ε -氨基>羥基。所以可以選取能夠特異性PEG修飾劑對(duì)數(shù)目稀少巰基進(jìn)行定向修飾。此類PEG修飾劑主要有:

(1)PEG-馬來(lái)酰亞胺(PEG-maleimide)

NHS-PEG-MAL

N3-PEG-MAL

Alkyne -PEG-MAL

Biotin-PEG-MAL

CHO-PEG-MAL

OPSS-PEG-MAL

(2) P E G- 鄰- 吡啶- 二硫醚( P E G -ortho-pyr idyl-disulphide) ;

Hydrazide-PEG-OPSS

Silane-peg-OPSS

Acrylates-peg-OPSS

Lipoic acid-peg-OPSS

Tosylate-peg-OPSS

Acetylthio-peg-OPSS

Aminooxy-PEG-OPSS

NPC-PEG-OPSS

SAS-PEG-OPSS

SC-PEG-OPSS

SCM-PEG-OPSS

SG-PEG-OPSS

SS-PEG-OPSS

(3)PEG-乙烯基砜(PEG-vinyl sulfone);

(4)PEG-碘乙酰胺(PEG-idoacetamide)。

其中,PEG-馬來(lái)酰亞胺應(yīng)用較多。但產(chǎn)物在水中不夠穩(wěn)定,容易發(fā)生開環(huán)反應(yīng)。Winslow[7]等在PEG與馬來(lái)酰亞胺之間添加芳香環(huán)作連接基團(tuán),并用來(lái)修飾血紅蛋白質(zhì),取得了更佳的修飾專一性。對(duì)于缺少巰基的蛋白質(zhì),可以通過(guò)基因工程在蛋白質(zhì)的合適位置引入巰基,再用相應(yīng)PEG進(jìn)行修飾。常用的引入位置有糖基化蛋白質(zhì)的糖基化位置、蛋白質(zhì)的抗原決定簇和蛋白質(zhì)末端等。此外,還可用Traut試劑處理蛋白質(zhì)引入巰基。此方法方便可靠,目前應(yīng)用最為廣泛。但缺點(diǎn)是半胱氨酸在蛋白質(zhì)內(nèi)多為重要活性基團(tuán)。因此這樣修飾有可能影響活性。

方法3：羧基的修飾

把PEG分子中的羥基轉(zhuǎn)化為氨基,然后在羧二亞胺存在下與蛋白質(zhì)的羧基縮合,得到修飾的蛋白質(zhì)(見(jiàn)圖4)。對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾時(shí),關(guān)鍵是修飾劑的選擇和修飾路線的確定。修飾路線的確定,要考慮使修飾蛋白質(zhì)能最大限度地保留原來(lái)生物活性,要能使其免疫原性降至最小程度,甚至完全解除,其中最佳修飾度的確定非常重要。修飾劑的選擇要考慮其結(jié)構(gòu)與性質(zhì),還要考慮其分子量大小。所以這兩方面的選擇是很重要的。

西安瑞禧生物科技有限公司可以提供的相關(guān)產(chǎn)品：

NH2-PEG-OPSS

NH2-PEG-OH

NH2-PEG-Hydrazide

NH2-PEG-Silane

NH2-peg-Acrylates

NH2-peg-Lipoic acid

NH2-peg-Acetylthio

NH2-PEG-Nitrophenyl Carbonates (NPC)

NH2-PEG-ValericAcids

NH2-PEG-Acrylamide

NH2-PEG-Bromide(Br)

NH2-PEG-Vinylsulfone(VS)

NH2-PEG-Methacrylate(MA)

NH2-PEG-Iodoacetate(IA)

NH2-PEG-Chloride

DBCO-PEG-NH2

TCO-PEG-NH2

Tetrazine-PEG-NH2

NH2-PEG-Folate

NH2-PEG-CHEMS