內(nèi)容提要

NIR-II熒光成像大大降低了幾乎所有組織類型在長(zhǎng)波長(zhǎng)下的散射系數(shù)，有利于深層組織成像。但是，大多數(shù)NIR-II熒光團(tuán)都存在量子產(chǎn)率低和/或循環(huán)時(shí)間短的問題，這限制了NIR-II成像的質(zhì)量。本文通過超分子組裝設(shè)計(jì)了一種具有強(qiáng)NIR-II熒光發(fā)射的蛋白質(zhì)/花菁復(fù)合物，在延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間的情況下， NIR-II量子產(chǎn)率達(dá)到21.2%。計(jì)算模型揭示了熒光增強(qiáng)的機(jī)理，確定了控制近紅外-II熒光團(tuán)白蛋白復(fù)合物的關(guān)鍵參數(shù)，提供了高分辨率的微血管成像，成像窗口長(zhǎng)達(dá)3小時(shí)。此外，絡(luò)合策略被應(yīng)用于抗體衍生的組件，提供高對(duì)比度的**成像，而不影響抗體的靶向能力。本研究為制備高性能的近紅外Ⅱ類熒光團(tuán)提供了一種簡(jiǎn)便的策略，即通過功能蛋白對(duì)菁染料進(jìn)行配伍，從而獲得高性能的NIR-II熒光團(tuán)。

前言

近紅外(NIR)熒光成像因其在術(shù)中成像的適用性而在醫(yī)學(xué)界獲得了廣泛的應(yīng)用。這種非侵入性成像方式，鑒于它的范圍是700到1000 nm也被稱為NIR-I成像。因?yàn)闊晒鈭F(tuán)可以被組織穿透的近紅外光重復(fù)激發(fā)，因此具有很高的靈敏度。與目前分子成像的臨床標(biāo)準(zhǔn)-放射性核素核成像技術(shù)相比，它具有更好的優(yōu)勢(shì)。此外，低毒成像探針允許隨時(shí)間延長(zhǎng)成像和/或重復(fù)掃描。此外，熒光發(fā)射的對(duì)比度使周圍組織的目標(biāo)組織清晰可見。這項(xiàng)技術(shù)有可能與其他成像方式(如光聲成像、超聲成像、磁共振成像和正電子發(fā)射斷層成像)相結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)多模式成像平臺(tái)。近紅外成像應(yīng)用包括血管造影、**和轉(zhuǎn)移灶以及淋巴管成像。到目前為止，僅僅吲哚青綠(ICG)和亞甲基藍(lán)，被美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于人體研究。ICG在臨床上用于心血管功能檢測(cè)和視網(wǎng)膜血管造影，但仍然存在光子衰減大、組織自發(fā)熒光和光散射等缺點(diǎn)。從1000到1700 nm的NIR-II成像為這些限制提供了一個(gè)有前途的解決方案。與NIR-I成像相比，這種成像方式提供了更大的穿透力和對(duì)比度。由無機(jī)納米顆粒和碳納米管衍生的近紅外II熒光團(tuán)顯示出生物相容性和安全性問題；其他典型的NIR-II熒光團(tuán)如供體-受體-供體(D-A-D)染料，量子產(chǎn)率很低。雖然延長(zhǎng)多亞胺結(jié)構(gòu)的共軛結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了有效的NIR-II熒光團(tuán)，但很少有水溶性或生物相容性的熒光團(tuán)。因此，NIR-II成像臨床轉(zhuǎn)化的主要障礙是滿足亮度和生物相容性要求的熒光團(tuán)數(shù)量有限?；ㄝ既玖系陌l(fā)射光譜橫跨整個(gè)NIR-I區(qū)域，發(fā)射尾部延伸到NIR-II窗口，因此，NIR-I探針可以被重新用于NIR-II生物成像，從而加速了這種成像方式向臨床轉(zhuǎn)化的過程。除了提供高對(duì)比度的**和血管成像，這些染料還表現(xiàn)出快速的肝膽清除。與無機(jī)納米探針相比，減少了與生物相容性和安全性相關(guān)的問題。然而，由于循環(huán)時(shí)間短，這些染料為血管成像提供了不到2min的成像窗口。這些染料與蛋白質(zhì)的生物結(jié)合可以延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間，盡管這可能會(huì)因?yàn)殁缧?yīng)而以亮度為代價(jià)。開發(fā)一種具有高QY和改善藥代動(dòng)力學(xué)特征的明亮的NIR-II熒光團(tuán)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。

本研究調(diào)查了花菁染料與牛血清白蛋白(BSA)的組裝是否會(huì)增加循環(huán)時(shí)間、量子產(chǎn)率、穩(wěn)定性和成像對(duì)比度。通過實(shí)驗(yàn)和計(jì)算模擬，我們確定了一種自組裝的IR-783@BSA，具有很高的穩(wěn)定性和熒光強(qiáng)度，適合于高對(duì)比度成像。IR-783@BSA的循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)，可在注射后3小時(shí)以超高對(duì)比度顯示小于3μm寬的血管。IR-783與白蛋白之間的納米分子結(jié)合親和力促進(jìn)了扭曲的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(TICT)過程和NIR-II量子效率的提高。通過設(shè)計(jì)白蛋白和菁染料之間的超分子組裝，該配合物可以保持扭曲的構(gòu)象，從而能夠提高TICT過程和循環(huán)時(shí)間。我們進(jìn)一步證明，這種方法可以擴(kuò)展到單克隆抗體(Erbitux)，以賦予分子靶向性。這項(xiàng)研究提供了一種簡(jiǎn)便的策略，通過用功能蛋白修飾菁染料來生產(chǎn)高性能的NIR-II熒光團(tuán)，這在臨床上顯示出很高的潛力。

結(jié)果與討論

通過超分子相互作用將菁染料與牛血清白蛋白組裝在一起，以創(chuàng)建穩(wěn)定的牛血清白蛋白包裹熒光團(tuán)的復(fù)合物。首先評(píng)估了三種候選染料IR-783、IR-12N3和ICG (IR-12N3在BSA緩沖液中的相對(duì)QY是ICG的2.8倍)。我們研究了菁染料與BSA的相互作用，并測(cè)定了與解離常數(shù)Kd=1 nM的很強(qiáng)的結(jié)合親和力。IR-783的相對(duì)近紅外光譜QY與IR-12N3相近。在牛血清白蛋白存在的情況下，通過將每種染料加熱到室溫到90°C的溫度來測(cè)試熒光團(tuán)的溫度依賴性。在60°C附近的溫度下，熒光強(qiáng)度增加了大約6倍。由于菁染料的TICT，IR-783也顯示出明亮的NIR-II尾部發(fā)射，啟發(fā)我們優(yōu)化所制備的復(fù)合物的NIR-II發(fā)射用于深度組織成像。我們使用四種合成策略制備復(fù)合物。第一個(gè)條件(C1)是將染料與牛血清白蛋白(BSA)自由混合，加熱10 min形成復(fù)合物。第二種(C2)包括谷胱甘肽(GSH)和10分鐘的加熱，GSH促進(jìn)二硫鍵的可逆斷裂以捕獲熒光團(tuán)。第三組(C3)加入谷胱甘肽和戊二醛(GTD)，戊二醛是一種伯胺交聯(lián)劑，加熱10分鐘。第四個(gè)(C4)指的是GTD和10分鐘加熱的組合。在優(yōu)化熒光團(tuán)與牛血清白蛋白(BSA)復(fù)合物的形成條件之前，我們利用FBS/PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)緩沖法建立了一個(gè)比值，通過監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度來測(cè)試該復(fù)合物的穩(wěn)定性。所有被測(cè)熒光團(tuán)在FBS中的熒光強(qiáng)度都高于在BSA中的熒光強(qiáng)度；因此，F(xiàn)BS/PBS中熒光團(tuán)的熒光比最接近1表明與BSA籠的穩(wěn)定性最高。我們測(cè)量了由上述四種方法(C1至C4)得到的三種熒光團(tuán)@BSA配合物的熒光強(qiáng)度、大小和穩(wěn)定性。IR-783@BSA復(fù)合物比IR-12N3@BSA和ICG@BSA復(fù)合物更穩(wěn)定。此外，IR-783@BSA配合物在60°C加熱后QY最高，熒光增強(qiáng)明顯高于另外兩個(gè)熒光團(tuán)@BSA配合物。因此，我們選擇IR-783@BSA進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。優(yōu)化程序包括優(yōu)化染料和白蛋白的比例和濃度，混合后的預(yù)孵育時(shí)間，孵育后10分鐘的加熱溫度(從室溫到70°C)，以及優(yōu)化穩(wěn)定性和尺寸，以獲得良好的熒光強(qiáng)度和體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)性能。我們首先優(yōu)化了IR-783在自由混合(C1)和谷胱甘肽(C2)條件下的濃度依賴性，證實(shí)了BSA：IR-783的比例高達(dá)1：1，并具有優(yōu)化的性質(zhì)，如尺寸、熒光強(qiáng)度和絡(luò)合物穩(wěn)定性。反應(yīng)體系的濃度控制在20 mg/mL以下，以避免聚集和過度交聯(lián)。通過測(cè)量復(fù)合物在不同孵育時(shí)間點(diǎn)的穩(wěn)定性和大小，將預(yù)孵育時(shí)間優(yōu)化為24小時(shí)。為了進(jìn)一步優(yōu)化穩(wěn)定性和發(fā)射亮度，在四種方法中的每一種都測(cè)試了三種不同比例的BSA：IR-783。我們觀察到，當(dāng)BSA：染料的比例為1：0.5和1：1時(shí)，復(fù)合物最穩(wěn)定，而當(dāng)比例為1：2時(shí)，復(fù)合物變得不穩(wěn)定。在GSH(C2)和GSH+GTD(C3)條件下，復(fù)合物的平均粒徑為~60 nm，而在自由混合(C1)和GTD(C4)條件下，復(fù)合物的平均粒徑小于20 nm，表明GSH方法導(dǎo)致了分子間交聯(lián)。透射電子顯微鏡、原子力顯微鏡和電泳分析也表明，與C1和C4相比，C2和C3產(chǎn)生了更大尺寸的復(fù)合物。從電泳分析中，我們觀察到納米復(fù)合物的單體、二聚體、三聚體和其他多聚體。因此，需要密度梯度離心法(DGU)純化以將復(fù)合物從較小的物種中分離出來，以獲得尺寸均勻的復(fù)合物。此外，10分鐘的加熱溫度對(duì)于形成穩(wěn)定的復(fù)合物也很重要，表明60℃和70℃滿足了定制大復(fù)合物的需要，更高的溫度可以產(chǎn)生更多的大納米復(fù)合物。

圖1。(A) 牛血清白蛋白包裹熒光團(tuán)復(fù)合物形成示意圖。(B) 用Kd值為1 nM的生物膜干涉法測(cè)定IR-783與白蛋白的動(dòng)力學(xué)結(jié)合。(C) 預(yù)混牛血清白蛋白的染料加熱10min后白度增強(qiáng)。(D) IR-783在牛血清白蛋白溶液中的吸收、近紅外-I和近紅外-II發(fā)射。(E) 60℃時(shí)，熒光團(tuán)(IR-783、IR-12N3和ICG)與牛血清白蛋白(1：1比)的熒光增強(qiáng)。(F) IR-783@BSA復(fù)合物(C1~C4是在60°C后處理10min合成的)的電泳分析。(G) IR-783@BSA復(fù)合物的電泳凝膠分析。

本文通過對(duì)接建模研究IR-783和白蛋白之間的姿勢(shì)和相互作用。IR-783的結(jié)合位點(diǎn)被鑒定為白蛋白的裂隙。雖然IR-783和ICG都被分配到相似的白蛋白結(jié)合位點(diǎn)，但I(xiàn)CG顯示出更高的自組裝傾向。自組裝行為的偏離反映了染料分子自組裝和染料與白蛋白相互作用這兩個(gè)相互競(jìng)爭(zhēng)的反應(yīng)之間的不同趨勢(shì)。我們?nèi)コ硕蜴I來模擬GSH處理后的部分變性白蛋白。通過平衡模擬得到了與IR-783進(jìn)一步對(duì)接的最佳構(gòu)象。產(chǎn)生的結(jié)合姿勢(shì)在IR-783和白蛋白的Trp214之間顯示出非常強(qiáng)的π-π堆積。色氨酸(Trp)是白蛋白中所有氨基酸殘基中最大的結(jié)合系統(tǒng)。當(dāng)共軛體系較大時(shí)，特別是當(dāng)分子與附近的分子有π-π相互作用時(shí)，最高占據(jù)分子軌道-最低空分子軌道(HOMO-LUMO)間隙通常較小。它們面對(duì)的芳香環(huán)之間的距離被預(yù)測(cè)為3.761?，這表明強(qiáng)電子耦合的距離非常短。IR-783和Trp214之間的強(qiáng)相互作用保持了IR-783的扭曲構(gòu)象，使得TICT過程和NIR-II QY得以增強(qiáng)。增強(qiáng)的TICT過程進(jìn)一步得到了在LC-BLYP*/6-31G(d)水平上的含時(shí)間密度泛函理論(TDDFT)計(jì)算的支持。圖2F和圖S5(G和H)中繪制了相應(yīng)的靜電勢(shì)(ESP)表面的HOMO、LUMO和MAP圖。對(duì)于NIR-I發(fā)射過程，計(jì)算的熒光波長(zhǎng)為775 nm，與實(shí)驗(yàn)測(cè)量值800 nm一致。HOMO和LUMO均沿整個(gè)分子骨架分布，表明存在較強(qiáng)的π-π*局域激發(fā)發(fā)射。根據(jù)IR-783與白蛋白之間最佳結(jié)合姿勢(shì)的對(duì)接建模，吲哚部分(二面角為90°)的旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生了一個(gè)不對(duì)稱的π-共軛主鏈，導(dǎo)致電荷重新分布，進(jìn)而誘導(dǎo)了TICT。計(jì)算的熒光波長(zhǎng)增加到~1433 nm，這與我們研究中觀察到的NIR-II發(fā)射相對(duì)應(yīng)(從1000 nm增加到1500 nm)。由于IR-783和Trp214之間的距離很短(<4 ?)，我們將系統(tǒng)擴(kuò)展到由IR-783和Trp214白蛋白組成的簇，使用相同的計(jì)算激發(fā)能的方法來理解IR-783@BSA情況下的高QY。計(jì)算結(jié)果表明，垂直激發(fā)包括從HOMO-1到LUMO的躍遷，其中HOMO-1幾乎位于Trp214的吲哚環(huán)上，而LUMO位于IR-783相對(duì)于Trp214的近半側(cè)。發(fā)射對(duì)應(yīng)于從LUMO到HOMO的轉(zhuǎn)變，在那里HOMO位于IR-783相對(duì)于Trp214的較遠(yuǎn)側(cè)。在最終發(fā)射之前，將發(fā)生從HOMO(IR-783)到HOMO-1(Trp214)的電子躍遷。HOMO和HOMO-1中心之間的距離約為12 ?。由于QY與壽命成正比，與躍遷速率成反比，HOMO和HOMO-1之間的長(zhǎng)距離解釋了實(shí)驗(yàn)中IR-783@BSA的高QY。

圖2。（A） IR -783@白蛋白復(fù)合物的對(duì)接建模。（B） IR-783和白蛋白之間的結(jié)合殘基和活性口袋的細(xì)節(jié)。（C和D）IR-783和ICG的分子間堆疊。（E） IR-783和白蛋白與部分二硫鍵裂解的對(duì)接建模。（F） TICT誘導(dǎo)的IR-783的NIR-I和NIR-II狀態(tài)轉(zhuǎn)換的示意圖。（G） LUMO（頂部），HOMO（中部）和HOMO-1（底部）是參與吸收（HOMO-1→LUMO）和發(fā)射（LUMO→HOMO）過程的三個(gè)主要分子軌道。（H） 吸收和發(fā)射形成三個(gè)步驟的循環(huán)。

我們使用優(yōu)化的IR-783@BSA復(fù)合體進(jìn)行了高對(duì)比度實(shí)時(shí)NIR-II血管成像。記錄的小鼠后肢血管的NIR-II視頻在1300納米的亞NIR-II窗口上產(chǎn)生了超對(duì)比度血管成像。主成分分析(PCA)被應(yīng)用于實(shí)時(shí)視頻成像，以區(qū)分靜脈和動(dòng)脈血管，受益于最大SBR和灌注周期。在NIR-II動(dòng)態(tài)成像中，在選定的5條血管上繪制感興趣區(qū)(ROI)，時(shí)間為30min。在ROI的基礎(chǔ)上，繪制的五個(gè)ROI的SBR值從1.3到7.6。我們進(jìn)一步評(píng)估了IR-783@BSA復(fù)合物的高亮度提供發(fā)光二極管(LED)激發(fā)的NIR-II成像的能力。與785 nm激光激發(fā)成像相比，清晰的后肢成像記錄在1300 nm以上，血管與肌肉信號(hào)比相等。與游離菁染料相比，延長(zhǎng)IR-783@BSA復(fù)合物的設(shè)計(jì)提供了令人印象深刻的血管分辨率和更長(zhǎng)的時(shí)間窗口。超亮IR-783@BSA復(fù)合體具有將NIR-II成像轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的巨大潛力。

圖3。(A) 記錄的小鼠后肢血管在幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的NIR-II視頻。(B) 實(shí)時(shí)視頻圖像的PCA分析區(qū)分了靜脈和動(dòng)脈血管，以及小血管和背景。(C) 在(A)的NIR-II視頻成像中對(duì)選定的五條血管的熒光強(qiáng)度剖面進(jìn)行監(jiān)測(cè)。(D) 在P.I.30min時(shí)血管與肌肉的信號(hào)比率。(E) IR-783@BSA復(fù)合體的高亮度可在較寬的NIR-II子窗口下提供低功率LED激發(fā)的后肢成像。(F) (E)中后肢的橫截面強(qiáng)度剖面(虛線)。(H) LED激發(fā)NIR-II成像系統(tǒng)方案。(I) 與游離IR-783相比，IR-783@BSA復(fù)合體的血管循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)。

在注射IR-783@BSA后，與來自NIR-I窗口的圖像相比，在NIR-II窗口中對(duì)小鼠大腦的NIR-II顯微成像提供了更清晰的血管輪廓，SBR大約增強(qiáng)了一倍。與活體NIR-II全身(2.5×)圖像相比，剃光頭的小鼠頭部在P.I.<30min時(shí)的NIR-II全身圖像。在IR-783@BSA復(fù)合物中，NIR-II顯微鏡圖像具有更好的分辨率，照亮了小至3μm的血管。IR-783@BSA復(fù)合物和游離IR-783圖像的血管與正常組織比率統(tǒng)計(jì)表明，IR-783@BSA復(fù)合物在NIR-II顯微鏡方法中顯示出優(yōu)越的血管成像能力。IR-783@BSA復(fù)合物的寬發(fā)射還潛在地實(shí)現(xiàn)了在NIR-I窗口具有峰值發(fā)射的雙光子成像。

圖4。(A) 小鼠腦的離體NIR-II顯微鏡成像。(B) 同一位置的NIR-I和NIR-II圖像的橫截面強(qiáng)度分布。(C) IR-783@BSA復(fù)合物作用于1300 nm和1200 nm長(zhǎng)通濾光片后，分別進(jìn)行了活體NIR-II全身(2.5×)、血管構(gòu)型和離體顯微鏡成像。(D) IR-783@BSA復(fù)合體和自由IR-783圖像的橫截面強(qiáng)度分布。(E) IR-783@BS復(fù)合體和游離IR-783圖像的血管與正常組織比率。

NIR-II窗口的分子成像具有顯著的SBR比率和深層組織穿透性，可以提供癌癥標(biāo)記物表達(dá)的更全面的視圖，以指導(dǎo)治療。在IR-783@BSA復(fù)合物研究成果的推動(dòng)下，我們開發(fā)了一種IR-783@Erbitux復(fù)合物，用于近紅外II分子靶向成像?？贵w和染料的復(fù)合物可以在NIR-II窗口中提供靶向成像。我們測(cè)試了IR-783@Erbitux復(fù)合物與陽性鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞(SCC)和陰性U87細(xì)胞裂解物的靶向能力，表明在60°C的篩選反應(yīng)條件下，表現(xiàn)出高熒光亮度，而不損失Erbitux對(duì)其受體的高靶向親和力。IR-783@Erbitux復(fù)合物與先前IR-FGP@Erbitux共軛物的比較表明，IR-783@Erbitux復(fù)合物與IR-FGP@Erbitux共軛物相比具有更好的SBR，主要是因?yàn)镮R-783的亮度增加。用IR-783@Erbitux染色的SCC細(xì)胞描述了基于抗體的復(fù)合物的持續(xù)靶向能力。尾靜脈注射IR-783@Erbitux復(fù)合物和游離IR-783后，SCC荷瘤小鼠的體內(nèi)NIR-II成像顯示了開發(fā)的IR-783@Erbitux具有強(qiáng)大的靶向能力。24小時(shí)后，IR-783@Erbitux的NIR-II**信號(hào)比游離IR-783高2~3倍。盡管肝臟攝取率高于基于白蛋白的復(fù)合物，成像質(zhì)量還不夠高，IR-783@Erbitux仍有望實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便的分子成像平臺(tái)。這種絡(luò)合有可能擴(kuò)展到嵌入熒光團(tuán)的功能性生物超分子，使其具有優(yōu)異的成像能力的多功能。

圖5。(A) IR-783@Erbitux復(fù)合物在陽性SCC細(xì)胞和陰性U87細(xì)胞上的細(xì)胞分析(裂解物)試驗(yàn)。(B) IR-783@Erbitux的鱗狀細(xì)胞染色描述了基于抗體的復(fù)合物的保留靶向能力。(C) 尾靜脈注射IR-783@Erbitux復(fù)合物，對(duì)荷鱗狀細(xì)胞癌小鼠進(jìn)行體內(nèi)NIR-II成像。(D) 在與IR-783@Erbitux病例相同的成像條件下，尾靜脈注射游離IR-783對(duì)一只SCC荷瘤小鼠進(jìn)行體內(nèi)NIR-II成像。(E) IR-783@Erbitux和游離IR-783在增加時(shí)間點(diǎn)P.I.的NIR-II**信號(hào)。(F) IR-783@Erbitux復(fù)合物在168小時(shí)時(shí)間點(diǎn)P.I.的體外生物分布。

結(jié)論

本文通過系統(tǒng)地剪裁花菁染料與血清白蛋白的超分子組裝，確定了一種性能優(yōu)越的復(fù)合物，具有更長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間和優(yōu)異的相對(duì)QY，揭示了牛血清白蛋白衍生的絡(luò)合物與菁染料結(jié)合的機(jī)理，為改善菁染料的藥代動(dòng)力學(xué)提供了支持。通過應(yīng)用GSH、GTD和熱的組合獲得了尺寸小于100 nm的自組裝IR-783@BSA復(fù)合物，具有高穩(wěn)定性和高熒光強(qiáng)度，使高對(duì)比度血管成像能夠在~3小時(shí)的成像窗口內(nèi)進(jìn)行，并應(yīng)用于抗體系統(tǒng)，通過IR-783@Erbitux復(fù)合物促進(jìn)表皮生長(zhǎng)因子受體靶向成像，從而實(shí)現(xiàn)了體外顯微鏡下的血管成像，以及體內(nèi)全身成像，照亮了小至3μm的血管。該平臺(tái)有可能擴(kuò)展到其他分子靶點(diǎn)進(jìn)行個(gè)性化治療。

參考文獻(xiàn)

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Haitao Sun, Xiaodong Zhang, Alexander L. Antaris, Bernard R. Brooks, Xiaoyuan Chen, Sci. Adv. 2019; 5: eaaw0672. DOI: 10.1126/sciadv.aaw0672. https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aaw0672

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