內(nèi)容提要

研究供體-受體-供體(D-A-D)結(jié)構(gòu)對(duì)熒光性質(zhì)的影響機(jī)制對(duì)小分子NIR-II熒光團(tuán)的設(shè)計(jì)具有重要意義?；谶@種D-A-D結(jié)構(gòu)，通過(guò)調(diào)節(jié)最高被占據(jù)分子軌道和最低未被占據(jù)分子軌道能級(jí)篩選吸電子或給電子基團(tuán)和π橋基團(tuán)，獲得NIR-II的熒光發(fā)射。以噻吩(T)、三苯胺(TPA)、9,9-二辛基芴(F)為電子供體，制備了系列以噻吩異靛藍(lán)(TIIG)、6,7-雙(4-己氧基苯基)-4,9-二(噻吩-2-基)-[1,2,5]噻二偶氮唑[3,4-g]喹惡啉(TTQ)為受體的D-p-D型NIR-II熒光團(tuán)，其中TTQ-F的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，量子產(chǎn)率最高。為了實(shí)現(xiàn)NIR-II生物成像的應(yīng)用，用PEG5k對(duì)具有理想NIR-II發(fā)射的TTQ-F進(jìn)行了修飾，獲得了聚乙二醇化的NIR-II聚合物TTQ-F-PEG，實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠血管、淋巴結(jié)、血管出血和胃腸道的體內(nèi)NIR-II顯像。

前言

自從首次應(yīng)用NIR-II(波長(zhǎng)在1000 ~ 1700 nm)熒光成像以來(lái)，由于具有顯著的低光子散射、最小的自熒光、高空間分辨率以及低信號(hào)衰減，在生理過(guò)程的可是化方面顯示出了巨大的潛力。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種具有足夠亮度的NIR-II熒光團(tuán)用于分子成像，包括小型有機(jī)熒光團(tuán)、量子點(diǎn)、單管碳納米管和稀土摻雜納米材料。由于有機(jī)NIR-II型熒光團(tuán)具有生物相容性好、化學(xué)結(jié)構(gòu)可設(shè)計(jì)、具有潛在的功能性等特點(diǎn)，是目前比較理想的熒光團(tuán)。在有機(jī)NIR-II熒光團(tuán)中，具有供體-受體-供體(D-A-D)結(jié)構(gòu)的探針是在NIR-II窗口發(fā)射的典型小分子有機(jī)熒光團(tuán)。6,7-雙(4-(己氧基)苯基)-4,9-二(噻吩-2-基)-[1,2,5]噻二偶氮并[3,4-g]喹惡啉(TTQ)和硫代異靛藍(lán)(TIIG)衍生物是典型的具有強(qiáng)吸電能力的共軛受體，它們具有可修飾的化學(xué)基團(tuán)，可與不同的給電子體反應(yīng)形成D-p-D型共軛分子。本研究以兩個(gè)強(qiáng)電子受體TTQ和TIIG為基礎(chǔ)，合成了8個(gè)NIR-II小分子。通過(guò)理論和實(shí)驗(yàn)測(cè)試研究和分析了由不同電子給體和受體組成的上述小分子的吸收和發(fā)射特性。以TTQ為受體合成的四種小分子(TTQ-Xs)的吸收光譜與以TIIG為受體合成的四種小分子(TIIG-Xs)的吸收光譜相似，但熒光光譜存在顯著差異。TTQ-Xs的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于TIIG-Xs, TIIG-Xs幾乎沒(méi)有熒光。TTQ-F在TTQ-X分子中表現(xiàn)突出，熒光量子產(chǎn)率(QY)最高，光穩(wěn)定性好。體內(nèi)NIR-II熒光實(shí)驗(yàn)表明，TTQ-F-PEG具有良好的NIR-II熒光性能。同時(shí)，LFP成像也顯示了TTQ-F-PEG具有高分辨率和高穩(wěn)定性的良好成像性能。

結(jié)果與討論

如圖1所示，潛在的NIR-II小分子染料采用了具有TIIG或TTQ的高效D-A-D結(jié)構(gòu)作為替代BBTD應(yīng)用最廣泛的部分，其合成復(fù)雜，產(chǎn)率低。為了考察D部分的作用，選擇噻吩(T)、三苯胺(TPA)、9,9-二辛基-芴(F)和2-(9,9-二辛基-芴)噻吩(TF)作為D部分與A偶聯(lián)，得到8種小分子染料。上述小分子染料有兩個(gè)系列，分別定義為TIIG-Xs：TIIG-T、TIIG-TPA、TIIG-F、TIIG-TF和TTQ-Xs: TTQ-T、TTQ-TPA、TTQ-F、TTQ-TF(圖1)。利用密度泛函理論計(jì)算了這些小分子染料的最高占據(jù)分子軌道(HOMO)和最低未占據(jù)分子軌道(LUMO)表面預(yù)測(cè)這些小分子染料的光物理性質(zhì)。圖1顯示了所有這些小分子染料的HOMO和LUMO波函數(shù)。所有HOMO都是沿著共軛主鏈離域的，而TTQ- Xs的LUMO主要定位在TTQ受體上，TIIG-Xs的LUMO分布更多地定位在D-A-D核上，表明TTQ-Xs降低了分子間相互作用的概率，有利于保持激發(fā)態(tài)能量。TTQ-Xs比TIIG-Xs具有更高的HOMO能級(jí)和更低的LUMO能級(jí)，從而保證了TTQ-Xs具有更低的帶隙。

圖1。D-p-D型小分子染料的合成與化學(xué)結(jié)構(gòu) /幾何優(yōu)化后的小分子染料的HOMO和LUMO能級(jí)。

TTQ-TF的帶隙最小(1.79 eV和1.20 eV)，具有較低的帶隙，是NIR-II小分子染料的理想受體。如圖2a所示，TIIG-Xs有兩個(gè)吸收峰，TTQ-Xs有一個(gè)寬的吸收峰。這兩種不同的受體基染料的主要峰位置都在600-700 nm。在相同的給體的情況下，吸收峰的紅移。TTQ-Xs TIIG-Xs最大吸收峰如下：TIIG-T (633 nm), TTQ-T(644 nm), TIIG-F (637 nm), TTQ-F(655 nm), TIIG-TPA (653 nm), TTQ-TPA (687 nm),和TIIG-TF (672 nm) TTQ-TF(695 nm)。這一結(jié)果主要是由于上述TTQ-Xs具有更多的離域LUMOs和更低的帶隙。730 nm激發(fā)TIIG-Xs和808 nm激發(fā)TTQ-Xs的NIR-II熒光發(fā)射光譜。如圖2b所示，TIIG-XS在THF中測(cè)量的NIR-II發(fā)射信號(hào)較TTQ-Xs弱。特別是TIIG -TPA和TIIG-TF的最大熒光發(fā)射峰無(wú)法在NIR-II區(qū)域檢測(cè)到。這些結(jié)果表明TIIG-Xs不適合進(jìn)一步的NIR-II成像應(yīng)用。TTQ-Xs在THF中的發(fā)射光譜在1000 ~ 1100 nm處有發(fā)射峰，并在1300 nm處有發(fā)射峰，允許在NIR-II區(qū)域有高分辨率的熒光成像，其中TTQ-F的熒光強(qiáng)度最高，發(fā)射峰在983 nm, TTQ-TPA的熒光強(qiáng)度最低，發(fā)射峰在1036 nm。TTQ-F顯示發(fā)射QY最高的6.97%，大大高于TTQ-T(3.97%)、TTQ-TPA(3.0%)和TTQ-TF(3.37%)。此外，還比較了TTQ-Xs在THF中溶解后的1064 nm長(zhǎng)通(LP)濾光片下的熒光和NIR-II熒光。顯然，TTQ-F在這些小分子染料中熒光信號(hào)最高，而TIIG-Xs化合物沒(méi)有信號(hào)(圖2c)。TTQ是構(gòu)建具有較強(qiáng)NIR-II發(fā)射的D-p-D型小分子的最優(yōu)受體，可用于進(jìn)一步的NIR-II成像。

圖2。(a) THF中測(cè)量的小分子染料的吸收光譜和(b) NIR-II熒光發(fā)射光譜。(c)亮場(chǎng)圖像(左)和NIR-II熒光圖像(右，808 nm激光;1064 nm LP濾光片)的小分子染料。

為了實(shí)現(xiàn)水溶性NIR-II納米顆粒 TTQ-X@NPs，為進(jìn)一步的成像應(yīng)用，將NIR-II熒光性能的TTQ-X染料被封裝在一種商用兩親性三嵌段共聚物(Pluronic F127)中。這些TTQ基NPs在水相中的吸收和熒光光譜與在有機(jī)相中的相似。如圖3a所示，分別在TTQ-T@NPs、TTQ-TPA@NPs、TTQ-F@NPs、TTQ-TF@NPs的737、764、733、781 nm處有主要的吸收峰。在808 nm激光激發(fā)下，TTQ-X@NPs的NIR-II熒光發(fā)射光譜顯示出明顯的發(fā)射帶NIR-II地區(qū)。TTQ-T@ NPs、TTQ-TPA@NPs、TTQ-F@NPs和TTQ-TF@NPs的最大發(fā)射峰位于1059、1065、1060和1071 nm大(圖3b)，其中，TTQ-F@NPs的熒光強(qiáng)度最高，分別是TTQ-T@NPs、TTQ-TPA@NPs和TTQ-TF@NPs的1.9、3.3和3.5倍(圖3b)。進(jìn)一步比較了1064 nm LP濾波器捕獲的這些水溶性NPs的NIR-II信號(hào)，結(jié)果與預(yù)期一致，TTQ-F@NPs顯示了最亮的NIR-II信號(hào)，這與熒光發(fā)射光譜的結(jié)果一致。

圖3。(a)水相測(cè)量的四種TTQ基NPs (TTQ-X@NPs)的吸收光譜和NIR-II熒光發(fā)射光譜。(c)用1064 nm濾光片過(guò)濾TTQ-X@NPs溶液管中的亮場(chǎng)圖像和NIR-II熒光圖像。所有這些數(shù)據(jù)都是在相同的質(zhì)量濃度為0.1 mg mL^?1時(shí)測(cè)量的。

為了獲得更大的生物成像應(yīng)用，我們選擇了具有良好NIR-II發(fā)射的TTQ-F，并進(jìn)一步改進(jìn)其水溶性。TTQ-F與氨基PEG快速反應(yīng)，得到了水溶性NIR-II 熒光聚合物TTQ-F- PEG(圖4a)。TTQ-F-PEG在5 mg mL^?1的高濃度水溶液中具有良好的溶解性。采用動(dòng)態(tài)光散射和透射電鏡(TEM)對(duì)水溶液中TTQ-F-PEG的粒徑和形貌進(jìn)行表征(圖4b)。TTQ-F-PEG具有均勻分散的球結(jié)構(gòu)，平均直徑為140 nm。作者研究了TTQ-F-PEG在固體或兩種介質(zhì)(THF和水)中的紫外-可見(jiàn)-近紅外吸收光譜和熒光光譜。如圖4c所示，TTQ-F-PEG在THF、固體和水中分別在741、798和792 nm處有主要的吸收峰。與NPs類似，TTQ-F-PEG在固體和水中表現(xiàn)出更大的紅移吸收波長(zhǎng)，而在THF中。TTQ-F-PEG在上述介質(zhì)中同時(shí)用808 nm激光激發(fā)，記錄了其NIRII熒光發(fā)射光譜。如圖4d所示，TTQ-F-PEG在THF、固體和水中的主發(fā)射峰分別在1000、1093和1073 nm處檢測(cè)到。這些結(jié)果表明TTQ-F-PEG具有良好的體內(nèi)外生物成像潛力。

圖4。(a) TTQ-F-PEG的化學(xué)結(jié)構(gòu)和(b)粒徑分布。圖中為TTQ-F-PEG的透射電鏡圖像。(c)分別測(cè)定了TTQ-F-PEG在THF、固體和水中的吸收光譜和(d) NIR-II熒光發(fā)射光譜。

如圖5b所示，TTQ-F-PEG在THF中比在水中表現(xiàn)出更亮的NIR-II信號(hào)。TTQ-F-PEG功率顯示出與THF溶液相當(dāng)?shù)臒晒?。此外，獲得了在雞肉組織管中測(cè)量的NIR-II熒光圖像(圖5c)和軟件分析的不同深度(0、2、4、6和8 mm)的定量熒光強(qiáng)度，以表征穿透深度。TTQ-F-PEG在NIR-II窗口的穿透深度可達(dá)約8 mm。TTQ-F-PEG在7天內(nèi)在水中表現(xiàn)出良好的尺寸穩(wěn)定性。因此，TTQ-F-PEG是一種很有前途的NIR-II熒光團(tuán)。在小鼠后肢和腹部血管1064 nm LP過(guò)濾器內(nèi)，靜脈注射劑量為15 mg kg^?1的TTQ-F-PEG后，捕獲808 nm激發(fā)下的NIR-II熒光圖像。如圖5d?f所示，大腦、腹部和后肢的血管系統(tǒng)可以清晰地從周?chē)谋尘敖M織中識(shí)別出來(lái)。此外，如圖5g?i所示，腦、腹、后肢血管半最大值全寬分別為0.48、0.68、0.48 mm。此外，體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TTQ-F-PEG的巨大安全性，即使劑量達(dá)到256 ug /mL，它對(duì)小鼠NIH3T3細(xì)胞的細(xì)胞毒性也可以忽略不計(jì)。因此，TTQ-F-PEG由于其較低的光子散射和較高的空間分辨率以及NIR-II光的信號(hào)衰減較低，因此具有良好的光學(xué)空間分辨率和對(duì)比度，從而具有較高的體內(nèi)圖像質(zhì)量。

圖5。(a) TTQ-F-PEG分別在四氫呋喃、固體和水的室內(nèi)光和近紅外(NIR)光照射下的照片和熒光圖像。(c) TTQ-F-PEG在不同深度(0、2、4、6和8 mm)的NIR-II圖像。在TTQ-F-PEG (2 mg mL?1和150 μL)處理的小鼠的大腦(d)、腹部(e)和后肢(f)血管系統(tǒng)的NIR-II熒光圖像顯示了紅色實(shí)線和血管寬度分析的橫斷面熒光強(qiáng)度剖面圖(g、h和i)。

由于TTQ-F-PEG具有理想的體內(nèi)NIR-II熒光性能，我們還利用這種四臂聚合物開(kāi)展了NIR-II成像的其它應(yīng)用。如圖6a、b所示，我們通過(guò)前足墊注射TTQ-FPEG，仰臥位和右側(cè)側(cè)臥位進(jìn)行淋巴結(jié)顯像，可清晰顯示胸、臂淋巴結(jié)。此外，我們還成像了小鼠后肢的血管出血，這是多種疾病的并發(fā)癥。如圖6c、d所示，在仰臥位和俯臥位分別觀察到感興趣區(qū)域血管出血的NIR-II圖像清晰清晰。而未出血的另一側(cè)肢體未見(jiàn)出血的NIR-II信號(hào)。最后，利用NIR-II成像的深穿透深度優(yōu)勢(shì)，成功實(shí)現(xiàn)了胃腸道成像。即使在注射后4h，在5mm深的位置，我們也能清楚地分辨出圖6e中的胃、大腸和回腸。解剖后，我們對(duì)健康小鼠的腸道器官也進(jìn)行了成像。如圖6f所示，在胃、小腸、結(jié)腸和直腸中分別可以觀察到較強(qiáng)的NIR-II信號(hào)。這些成像應(yīng)用表明，我們合成的四臂TTQ-F-PEG具有優(yōu)異的NIR-II熒光性能。

圖6。前足墊注射TTQ-F-PEG允許NIR-II顯像(a)仰臥位胸廓淋巴結(jié)和(b)右側(cè)側(cè)位臂彎淋巴結(jié)。小鼠后肢血管出血的NIR-II FI分別為(c)仰臥位和(d)俯臥位。血管出血區(qū)域以紅色虛線為界。(e)健康小鼠通過(guò)口服TTQ-F-PEG的NIR-II胃腸道成像和(f)解剖后腸道器官的NIR-II 熒光成像。

由于TTQ-FPEG具有良好的NIR-II 熒光性能、良好的光學(xué)穩(wěn)定性和低毒性，該小分子在LFP的開(kāi)發(fā)中具有較高的分辨率、靈敏度和選擇性。TTQ-F-PEG可與淀粉混合形成TTQ-F-PEG/淀粉熒光粉，實(shí)現(xiàn)良好的流動(dòng)性，實(shí)現(xiàn)指紋顯影。如圖7a、b所示，TTQ-F-PEG/淀粉的主要吸收峰和熒光峰出現(xiàn)在804和1103 nm左右，這與圖4c、d中TTQ-F-PEG固體的上述結(jié)果相似。TTQ-F-PEG/淀粉的NIR-II FI信號(hào)被1064 nm LP濾波器捕獲(圖7c)，這表明TTQ-F-PEG/starch具有開(kāi)發(fā)LFP的巨大潛力。為了測(cè)試TTQ-F-PEG/淀粉型熒光粉的LFP檢測(cè)功能，我們選擇了塑料、錫箔紙和玻璃三種典型底物來(lái)評(píng)估其可行性。如圖7d所示，由于TTQ-F-PEG/淀粉引起的熒光信號(hào)在NIR-II窗口的高對(duì)比度，所有底物上都成功檢測(cè)到LFP。即使在儲(chǔ)存4周后，LFP的NIR-II熒光圖像仍然明亮清晰，說(shuō)明TTQ-F-PEG/淀粉具有很高的穩(wěn)定性(圖7e)。

圖7。(a) TTQ-F-PEG/淀粉的吸收和熒光發(fā)射光譜。(c) TTQ-F-PEG/淀粉分別在室內(nèi)光和近紅外光下的照片和熒光圖像。(d)分別在NIR-II光照射下，在塑料基材、錫箔紙和玻璃上的TTQ-F/淀粉染色LFP的熒光照片。(e)上述TTQ-F/淀粉染色LFP樣品儲(chǔ)存4周后的熒光照片。

結(jié)論

作者合成了8個(gè)以TTQ和TIIG為受體，T、TPA、F、TF為供體的D-p-D型有機(jī)小分子。理論計(jì)算和實(shí)驗(yàn)均證實(shí)TTQ作為較大的受體獲得了較長(zhǎng)的NIR-II發(fā)射波長(zhǎng)。此外,它是發(fā)現(xiàn)TTQ-F最亮NIR-II 熒光信號(hào)和優(yōu)良的耐光性,因?yàn)榧t移吸收/發(fā)射樂(lè)隊(duì)和顯著增強(qiáng)QY 6.97%的電子基效應(yīng)造成的。TTQ-F經(jīng)氨基聚乙二醇修飾后，在近紅外窗口獲得了一種吸收/發(fā)射波長(zhǎng)為792/1073 nm的水溶性聚合物，可進(jìn)一步準(zhǔn)確成像小鼠血管、淋巴結(jié)、血管出血和胃腸道，分辨率高。TTQ-F-PEG/淀粉熒光粉可以改善LFP的開(kāi)發(fā)和鑒定。不同底物上的熒光可以達(dá)到快速、靈敏的熒光效果。更重要的是，TTQ-F-PEG/淀粉的制備和LFPs的開(kāi)發(fā)都比發(fā)煙法等傳統(tǒng)方法更簡(jiǎn)單、更安全、更快。各種電子供體和基于TTQ受體的小分子NIR-II染料的設(shè)計(jì)帶來(lái)了新的意義，具有強(qiáng)大熒光信號(hào)的TTQ- F在進(jìn)一步生物成像應(yīng)用方面具有巨大的潛力。

產(chǎn)品提供

近紅外二區(qū)熒光染料