內(nèi)容提要

樹突狀細(xì)胞(DC)疫苗是一種有效的癌癥免疫治療策略，通過(guò)將抗原攜帶到樹突狀細(xì)胞中，并在接種后將樹突狀細(xì)胞移出引流淋巴結(jié)。本文報(bào)道了一種用于攝取抗原和激活樹突狀細(xì)胞的第二近紅外窗口(NIR-II)熒光納米顆粒。將卵清蛋白(OVA，一種免疫抗原) 通過(guò)靜電相互作用負(fù)載在聚賴氨酸(PLL) 修飾的NIR-II熒光納米顆粒的表面，表現(xiàn)出生物相容性和強(qiáng)的選擇性相互作用。這些載抗原復(fù)合物可被未成熟樹突狀細(xì)胞有效吞噬，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟并分泌細(xì)胞因子。皮下注射后，納米粒子高度敏感的NIR-II熒光信號(hào)表明，納米粒子標(biāo)記的樹突狀細(xì)胞可以成功地在體內(nèi)遷移到淋巴結(jié)，在癌癥免疫治療方面顯示了的巨大前景。

前言

**疫苗、過(guò)繼T細(xì)胞治療和免疫檢查點(diǎn)封鎖是近年來(lái)**免疫治療領(lǐng)域的三種主要方法，受到了廣泛關(guān)注。癌癥疫苗可以啟動(dòng)免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)對(duì)癌細(xì)胞特異性抗原表達(dá)的保護(hù)性免疫。樹突狀細(xì)胞(DC)是最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，在激發(fā)T細(xì)胞中起著關(guān)鍵作用。近年來(lái)，許多DC疫苗被開發(fā)用于癌癥免疫治療，活化的DC作為DC疫苗用于免疫治療來(lái)解決這些問(wèn)題。在基于DC的免疫治療中，DC的有效性是關(guān)鍵，因此實(shí)時(shí)的DC跟蹤就顯得尤為重要。實(shí)時(shí)的體內(nèi)DC成像可以為臨床治療中分析活化的DC如何遷移和改進(jìn)治療方法提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)。目前已經(jīng)發(fā)明各種非侵入性追蹤系統(tǒng)來(lái)追蹤DC，包括熒光成像，磁共振成像(MRI)，正電子發(fā)射斷層掃描(PET)和閃爍成像。盡管DC跟蹤技術(shù)取得了很大的進(jìn)展，但由于現(xiàn)有成像系統(tǒng)的局限性，在高靈敏度的體內(nèi)精確計(jì)算DC的遷移仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。近年來(lái)，第二近紅外窗口(NIR-II)熒光成像(1000 - 1700 nm) 以較長(zhǎng)的波長(zhǎng)探測(cè)光子，可以減少光子在自身熒光較低的生物組織中的散射，實(shí)現(xiàn)更高的空間分辨率和更深的組織穿透，得到了廣泛的研究。有機(jī)分子材料因其良好的生物相容性和快速排泄能力而受到研究者的青睞。本研究作者開發(fā)了一種新的DC疫苗，具有體內(nèi)NIR-II熒光跟蹤能力的抗原傳遞系統(tǒng)，合成了一種四臂聚合物TTQ- PLL，具有電子給體-受體(D-A)熒光核，產(chǎn)生NIR-II熒光信號(hào)。該聚合物負(fù)載雞蛋卵清蛋白(OV A)，可以有效結(jié)合OV A形成TTQ-PLL@OV A復(fù)合物。該復(fù)合物易于被樹突狀細(xì)胞攝取，并通過(guò)增強(qiáng)免疫因子分泌刺激標(biāo)記樹突狀細(xì)胞達(dá)到更高的成熟水平。這種樹突狀細(xì)胞從腳掌到引流淋巴結(jié)的歸巢機(jī)制可以通過(guò)NIR-II熒光成像進(jìn)行監(jiān)測(cè)，為基于NIR-II探針的免疫治療領(lǐng)域帶來(lái)了廣泛的興趣。

結(jié)果與討論

考慮到內(nèi)涵體和溶酶體中存在蛋白酶，研究了TTQ-PLL在不同pH下的光學(xué)性質(zhì)。TTQ-PLL顯示最大吸收約740 nm，NIR-II熒光發(fā)射在1050 nm。在808 nm激發(fā)下，TTQ-PLL pH值7.4的熒光強(qiáng)度略低于在pH值為5.0(圖1)，因此，TTQ-PLL具有在生理?xiàng)l件下具有良好的光學(xué)特性。在808 nm激光照射1 h后，熒光強(qiáng)度沒有明顯變化，具有良好的光穩(wěn)定性。根據(jù)pH 7.4和5.0下動(dòng)態(tài)光散射的結(jié)果，TTQ-PLL的水動(dòng)力粒徑分別約為44.2和41.7 nm(圖1c)。TEM圖像顯示TTQ-PLL的半徑約為40 nm (圖1d)。以IR1061為參考，測(cè)得TTQ-PLL的熒光QY為1.24%。TTQ-PLL可以作為NIR-II熒光探針進(jìn)行進(jìn)一步研究。如圖2e, f)所示， 0、1、4、6和8 mm雞乳肉組織下TTQ-PLL的NIR-II熒光圖像和強(qiáng)度結(jié)果表明，TTQ-PLL的NIR-II熒光信號(hào)的組織穿透率可達(dá)~6 mm。因此，這些數(shù)據(jù)表明TTQ-PLL可以作為一種NIRII熒光探針。

圖1。 (a) TTQ-PLL在pH 7.4和5.0下的紫外-可見吸收光譜，(b)熒光光譜和(c)水合動(dòng)力學(xué)尺寸。(d) TTQ-PLL TEM圖像。(f) TTQ-PLL在0、1、2、4、6、8 nm處的NIR-II熒光強(qiáng)度。

將不同比例的OVA與TTQ-PLL混合10 min，在PBS中制備TTQ-PLL@OV A納米粒子，并利用FITC對(duì)OV A進(jìn)行預(yù)標(biāo)記以跟蹤這一過(guò)程。由于陽(yáng)離子側(cè)鏈密度高，TTQ-PLL的負(fù)載率達(dá)到18.69%。通過(guò)TEM和DLS分析研究了配合物的形貌和尺寸，如圖2a, b所示。在pH 7.4和5.0條件下，TTQ-PLL@OV A復(fù)合物的水合動(dòng)力粒徑分別為49和46 nm，TEM粒徑為45 nm。由于與OV A結(jié)合，TTQ-PLL@OV A的粒徑比結(jié)合前大。如圖2c所示，由于賴氨酸側(cè)鏈上的氨基，TTQ-PLL帶正電荷。將OV A與這些納米粒子混合后，Zeta電位顯著降低。圖2d顯示了不同pH值下OVA的釋放曲線。pH值為5.0時(shí)，8 h后OVA的釋放量為80%，而pH值為7.4時(shí)，8 h后OVA的釋放量?jī)H為27.1%，這可能與PLL在酸性條件下的質(zhì)子化有關(guān)。由于內(nèi)涵體和溶酶體的酸性環(huán)境以及較低pH下OVA的快速釋放，TTQ-PLL可能在進(jìn)入樹突狀細(xì)胞后釋放OVA，并被這些細(xì)胞作為抗原呈現(xiàn)。

圖2 (a) TTQ-PLL在pH 7.4和5.0下的水合動(dòng)力學(xué)尺寸。(b) TTQ-PLL@OVA的TEM圖像(c) TTQ-PLL@OV A不同質(zhì)量比時(shí)的Zeta勢(shì)。(d) OVA在不同pH值下TTQ-PLL的釋放。

為了研究TTQPLL@OV A的潛在應(yīng)用，采用MTT法對(duì)其細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。因?yàn)樯锟山到夂蜕锵嗳莸木?/span>TTQ-PLL和TTQ-PLL@OVA對(duì)樹突細(xì)胞幾乎沒有細(xì)胞毒性，表明其具有良好的生物相容性，具有作為樹突細(xì)胞疫苗的潛力。為了研究細(xì)胞攝取，FITC標(biāo)記OVA制備TTQ-PLL@OVA復(fù)合物，采用流式細(xì)胞術(shù)分析DC對(duì)FITC-OVA的攝取。DCs是分別處理OVA和TTQPLL@OVA復(fù)合物為0, 0.5, 1, 1.5, 2 h。TTQ-PLL@OV經(jīng)處理的細(xì)胞顯示熒光強(qiáng)度明顯高于OVA 2 h后經(jīng)處理的細(xì)胞治療,這表明TTQPLL@OV優(yōu)于OVA抗原遞送(如圖3 a和3b)。作者進(jìn)一步采用NIR-II熒光成像技術(shù)研究了體外細(xì)胞攝取情況。用TTQPLL@OVA (QY=1.18%)孵育2 h后，捕獲DC的NIR-II熒光圖像。由于TTQ-PLL@OVA的攝取，TTQ-PLL@OVA孵育的DCs的NIR-II熒光信號(hào)顯著高于對(duì)照組 (圖3c, d)。因此，TTQ-PLL@OVA孵育的DCs適用于體內(nèi)示蹤。

圖3。FITC-OVA， (b) TTQ-PLL@FITC-OV A孵育的DC中FITC標(biāo)記OVA的變化。(c) NIR-II熒光圖像和(d) TTQPLL@OV A孵育后DC的強(qiáng)度。

DC成熟程度是DC免疫治療中反映免疫反應(yīng)的重要指標(biāo)，可通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞膜上CD80+和CD86+的表達(dá)水平來(lái)確定。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)條件下樹突狀細(xì)胞CD80+和CD86+的表達(dá)水平，探討樹突狀細(xì)胞成熟水平。在圖4a中，培養(yǎng)后CD80+和CD86+的百分比均顯著增加TTQ-PLL@OVA。同時(shí)，OVA和TTQ-PLL處理的細(xì)胞中，成熟樹突狀細(xì)胞的比例從5.0%顯著增加到24.7%，而游離OVA和TTQ-PLL處理的細(xì)胞中，成熟樹突狀細(xì)胞的比例分別僅達(dá)到5.1%和8.2%。TTQ-PLL@OVA處理后，DC成熟水平顯著提高了約5倍。這些結(jié)果表明，DC成熟水平的提高可歸因于TTQ-PLL@OVA易于被DC吸收，最終導(dǎo)致更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。治療后釋放的細(xì)胞因子，如TNF-α和IL-1β，觸發(fā)了樹突狀細(xì)胞的成熟、活化和免疫刺激活性。本研究采用ELISA試劑盒檢測(cè)樹突狀細(xì)胞分泌TNF-α和IL-1β。如圖4b和4c，TTQ-PLL@OVA孵育的樹突狀細(xì)胞中TNF-α和IL-1β的分泌量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無(wú)TTQ-PLL或OV A孵育的樹突狀細(xì)胞，TTQ-PLL可以釋放OV A誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟并釋放細(xì)胞因子。因此，這些由TTQPLL@OV A激活的具有細(xì)胞因子分泌能力的成熟樹突狀細(xì)胞可以作為DC疫苗。

圖4。TTQ-PLL@OV A體外免疫調(diào)節(jié)活性。(a)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD80+和CD86+表達(dá)。(b) TNF-α和(c) IL-1β的分泌通過(guò)ELISA法測(cè)定。

在基于樹突狀細(xì)胞的免疫治療中，活化樹突狀細(xì)胞遷移到引流淋巴結(jié)是基于DC的免疫治療的關(guān)鍵。高靈敏度的體內(nèi)DC跟蹤是非常理想的，可以為臨床治療中改進(jìn)治療方法提供有價(jià)值的信息。作者將TTQ-PLL@OVA和TTQ-PLL標(biāo)記的樹突細(xì)胞分別注射到C57BL/6小鼠的左足墊，模擬遷移的進(jìn)程。給藥后用NIR-II熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)DCs的NIR-II熒光信號(hào)。在TTQPLL@OVA標(biāo)記的樹突狀細(xì)胞注射后24 h，淋巴結(jié)內(nèi)可見NIR-II熒光信號(hào)，48 h時(shí)該信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng)，說(shuō)明TTQPLL@OVA標(biāo)記的樹突狀細(xì)胞從注射部位逐漸遷移到引流淋巴結(jié)(圖5a)。對(duì)DC注射側(cè)和TTQ-PLL@OVA標(biāo)記的dc注射側(cè)淋巴結(jié)進(jìn)行體外成像(圖7b, c)，證實(shí)了TTQ-PLL@OV A標(biāo)記的樹突細(xì)胞可以有效地呈現(xiàn)抗原，并促進(jìn)樹突細(xì)胞向局部淋巴結(jié)遷移。注射后14天后進(jìn)行了(H&E)染色主要器官(心、肝、脾、肺和腎)的組織學(xué)檢查顯示TTQ-PLL@OV A標(biāo)記dc具有良好的生物安全性。

圖5。(a) 通過(guò)足墊注射模型評(píng)估樹突狀細(xì)胞對(duì)局部淋巴結(jié)的靶向能力(紅色箭頭表示注射部位，紅線包圍的圓圈區(qū)域表示局部淋巴結(jié))。(b)局部淋巴結(jié)歸巢成像和(c)標(biāo)記樹突狀細(xì)胞處理后的平均熒光強(qiáng)度。

結(jié)論

作者合成了一種NIR-II熒光探針，該探針具有良好的水溶性、良好的光穩(wěn)定性和較強(qiáng)的載抗原能力，可用于OVA遞送系統(tǒng)。在負(fù)載該抗原后，TTQ-PLL@OVA可以有效地誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟和細(xì)胞因子的釋放，還可以標(biāo)記樹突狀細(xì)胞可作為樹突狀細(xì)胞疫苗，利用其固有的NIR-II熒光信號(hào)跟蹤DC在體內(nèi)向淋巴結(jié)遷移的過(guò)程，對(duì)于了解刺激樹突狀細(xì)胞在基于樹突狀細(xì)胞的免疫治療中遷移和功能的細(xì)節(jié)具有重要的臨床意義。

參考文獻(xiàn)

Chao Wang, Bo Sun, Hui Bao, Tao Wang, Wenjuan Xu, Pengfei Sun*, Quli Fan*, Wei Huang, NIR-II probe modified by poly(L-lysine) with efficient ovalbumin

delivery for dendritic cell tracking, Sci. China Chem, 2020, 63, 1272-1280.

DOI：10.1007/s11426-020-9780-8.

https://link.springer.com/article/10.1007/s11426-020-9780-8

產(chǎn)品提供

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